Анализ ПЦР на гепатит В (Б): качественный и количественный. Расшифровка: норма и отклонение

Что такое пцр и его виды

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это более быстрый и точный метод, что направлен на поиск возбудителя заболевания, путем существенного повышения части ДНК вируса гепатита в образце.

Анализ проводится путем забора крови, которую в последующем помещают в специальные реактивы, в которых происходит клонирование клеток. Из одной клетки получается две, и так далее. В итоге появляются сотни ДНК, благодаря которым можно диагностировать возбудитель и выявить вирус на ранней стадии.

ПЦР делится на несколько видов:

  • Качественный анализ — распознает гены инфекция в крови. Если при проведении качественного анализа у пациента подтверждается заболевание, то следует провести количественный анализ, устанавливающий степень инфекции. В результате проведения данной диагностики специалисты пишут “обнаружено/ не обнаружено”. “Обнаружено” — говорит о том, что недуг присутствует в организме и выявлен уже его РНК. “Не обнаружено” — свидетельствует об отсутствии в пробе гена вируса, то есть РНК гепатита отсутствует. Но врачи рекомендуют провести повторное исследование через 10 дней.
  • Количественный анализ — определяет объем генетического материала инфекции в крови. Такая диагностика помогает установить тяжесть болезни и всю клиническую историю. В результате такого анализа может быть написано только: “Положительно/Отрицательно/Недействительный”. “Положительно” — изображает инфекционную нагрузку. Доктора такой метод диагностики болезни назначают для определения действенности проводимого лечения на 4, 12, 16 и 24 неделях болезни. Если показатель вируса находится в диапазоне 8х10т МЕ/мл, то лечение эффективно, если показатели выше — то нет. “Отрицательно” — ген инфекции не обнаружен. “Недействительный” — такое бывает, если ген вируса обнаружили при качественном, но при этом не выявили при количественном анализе. Встречается подобное при условии, что объем инфекции ниже уровня.

Отличием количественного анализа есть то, что не все его проходят. Качественный — определяет наличие, а количественный — помогает с подтверждением заключения «вирус гепатита», прогнозом протекания болезни и определения хода лечения.

Насколько эффективна терапия, смотрят по числу РНК до и во время лечения. Также с его помощью определяют назначение доз препаратов.

В каких случаях делают количественный анализ

Исследование делается параллельно с качественным анализом после того, как проверка крови на наличие антител к гепатиту (ИФА) показала положительный результат. Делают его несколько раз:

  • При первичной диагностике гепатита С до принятия решения о выборе курса лечения;
  • Во время лечения заболевания (обычно на 1, 4, 12 и 24 неделе) для определения клинической картины результатов терапии;
  • После лечения для определения рецидива.

Количественный анализ является одним из основных видов исследования, на которые врач полагается при выборе методов лечения гепатита. Он служит для того чтобы:

  • Понять как сильно организм заражен вирусом, количественное присутствие антигенов в теле.
  • Эффективности выбранной терапии.
  • Подобрать метод лечения и составить его прогноз.
  • Анализ крови, эластометрия, биопсия и другие.

Как правило, его производят до начала излечения. Основными показаниями могут быть:

  1. Определение вирусной нагрузки и контроль за антивирусной терапией;
  2. Качественный ПЦР нашел антитела гепатита С;
  3. Нахождение острого и хронического гепатита С;
  4. Существование микст-гепатитов;
  5. При планировании лечения;
  6. Если качественное исследование еще находит присутствие болезни по прошествии двенадцатой недели терапии.

Интерпретация данных

Интерпретировать данные качественного измерения несложно. Он дает либо положительный, либо отрицательный ответ.

При количественной реакции оценить полученные показатели можно в зависимости от числа копий ДНК. Единицей измерения является копий/мл.

Расшифровываются данные следующим образом:

  1. Если количество ДНК ВГВ менее 90, то инфекция отсутствует. У пациента развился поствакцинальный иммунитет, либо он излечился от болезни.
  2. При числе копий 2х100 говорят о носительстве вируса.
  3. Количество 2х106 свидетельствует о хронической стадии болезни.
  4. При ДНК более 2х109 пациент болен острой стадией гепатита.

Качественный пцр

Качественный ПЦР позволяет только установить присутствие возбудителя в крови. Если они отсутствуют, то пациент не заражен, при попадании возбудителя в кровь результат будет положительным.

Однако, с помощью качественной реакции невозможно уточнить геном вируса, этап заболевания. Поэтому для диагностики ВГВ проводят как количественное, так и качественное измерение.

Плюсы методики

  1. Методика ПЦР дает возможность дать заключение и назначить правильное лечение.
  2. Быстрота результатов — не требует разграничения и выращивания видов возбудителя. Автоматизация процесса позволяет обрабатывать и изучать материал с получением результата за 4−5 часов.
  3. Прямота определения возбудителя — найдя особую часть ДНК, прямо указывает на наличие недуга. Например, ИФА — находит белки-маркеры (продукты жизнедеятельности бактерий), что не дает точного подтверждения наличия болезни.
  4. Специфичность — исследуется вещество, характерное только для конкретного возбудителя, что исключает реакцию на ложные совместно-реагирующие агенты.
  5. Восприимчивость — может обнаружить самое малое количество вирусов.
  6. Универсальность — основывается на нахождении фрагментов ДНК или РНК конкретных организмов. Это дает возможность провести диагностику для любых агентов из одного биоматериала, если другие методы бессильны.
  7. Выявляет не только явные, но и скрытые инфекции — эффективен для изучения агентов трудно выращиваемых, не выращиваемых, стойких.

К сожалению, диагностика может быть ошибочной. Очень важно проходить ПЦР в клинике, которая хорошо себя зарекомендовала. Ведь несмотря на то, что ПЦР определяет наличие вируса с точностью до 100%, этот показатель может снизиться до 95%, если учреждение использует устаревшее оборудование или неподходящие реактивы.

При правильной подготовке к анализу в современных лечебных центрах такая вероятность близка к нулю.

Подготовка к обследованию

Для проведения анализа методом полимеразной реакции необходима венозная кровь. Это необходимо сделать утром на голодный желудок.

Пациенту следует правильно подготовиться к исследованию:

  1. За 10 часов отказаться от пищи, можно пить только чистую воду.
  2. Накануне прекратить прием алкоголя, за 4 часа не курить.
  3. Перед обследованием стоит избегать физических и эмоциональных стрессов.
  4. За 2 суток перестать употреблять лекарства, если это невозможно, то необходимо предупредить лаборанта. Некоторые препараты оказывают влияние на конечный результат.

Подготовка к сдаче крови на количественный анализ

Сдача биоматериала на проведение анализа происходит из вены. Особых рекомендаций по подготовке нет, поэтому актуальны стандартные правила, которые нужно соблюдать перед сдачей крови на исследование:

  • Делать это лучше утром натощак (последний прием пищи должен быть не ранее 8-12 часов до сдачи).
  • Если забор крови происходит не утром, то на завтрак нельзя употреблять жирную пищу (интервал в 8-12 часов также должен соблюдаться).
  • Отказаться от алкоголя, жирной и жаренной еды за 1-2 дня до исследования.
  • Не приходить на анализ на следующий день после праздничного застолья.
  • Курение запрещено как минимум за час до сдачи биоматериала.
  • Перед забором крови стоит посидеть 10-15 минут в спокойствии, чтобы расслабить тело, исключить влияние на результаты напряжения, как физического, так и психологического.
  • Если принимаете какие-либо лекарственные средства или им подобные препараты, то анализ можно сдавать спустя 10-14 дней после последнего их приема. (об этом факте необходимо сообщить врачу, возможно он установит иное условие).
  • Биоматериал не сдается сразу после выполнения ректального исследования, рентгенографии, физиотерапевтических процедур.
  • Первоначальный и повторный анализы лучше сдавать в одной и той же лаборатории (медицинском учреждении), так они разные заведения могут использовать различные реагенты, оборудование, единицы измерения и точность.

Срок выдачи результатов отличается в зависимости от медицинского учреждения и его загруженности. Итоги можно подвести спустя 4-5 часов после начало исследования. Поэтому результат могут выдавать уже на следующий день после забора крови.

Расшифровка результатов результатов количественного анализа на вирус гепатита с и b

После проведения исследования расшифровать анализ могут не в цифрах, а словами: «ниже диапазона измерений» и «не обнаружено». Количественный ПЦР более чувствителен качественного. Вывод «не обнаружено» может говорить, что инфекция не найдена.

«Ниже диапазона измерений» — испытание не нашло вирус, но он есть в малой величине. В этой ситуации делают повторное исследование.

Вирусная нагрузка — определение числа инфекционного РНК в установленном объеме крови (количественно 1мл=1куб.сан). Формулируется в интернациональных замерах МЕ/мл. Отдельные лаборатории обозначают копии/мл. Коэффициенты перевода разные (колеблются примерно от 1 до 5) и зависит от метода, использованного для определения количественного показателя.

В основном на практике принято, что 1 МЕ/мл = 4 копиям на мл. Расшифровать перевод компонентов в межнациональные значения различные тест-системы могут по-своему.

При гепатите C нормами ПЦР выступают следующие значения вирусной нагрузки(виремии):

Цифровое обозначение числа вируса Описание итога
Не обнаружено Норма для здорового человека. Вирус не найден или исход ниже грани чувствительности методики.
До 1.8*10^2 МЕ/мл (7,5*102 копий/мл) Обнаружено в концентрации ниже линий границы.
До 8*10^5 МЕ/мл (2*106копий/мл) Обнаружен вирус при хорошем прогнозе болезни и эффективном лечении. Низкая вирусная нагрузка.
Больше 8*10^5 МЕ/мл (2*106 копий/мл) Обнаружено вирус и большая вирусная нагрузка.
Больше 2,4*10^7 МЕ/мл (1*108 копий/мл) Обнаружен вирус в концентрации выше линейного диапазона.

Когда человек здоров, норма есть — «не обнаружено». У заболевших людей нормой будет снижение дозы вируса в результатах на логарифмическую единицу, что проявляется убыванием числа нулей в анализе на один (например, с 1*106 МЕ/мл до 1*105 МЕ/мл). Рамки диапазона концентрации вируса, что определяет амплификатор, находятся в границах 1,8*102 — 2,4*107 МЕ/мл.

  1. Если при повторном анализа нагрузка вируса является меньшей, чем 8*105 МЕ/мл, то можно утверждать, что терапия идёт в правильном направлении и в борьбе с заболеванием есть успех.
  2. Говорить о раннем вирусологическом ответе можно при условии снижения количественного присутствия РНК вируса на третий день лечения. Но вероятность этого находится на уровне 85%.
  3. Если же, показатель более 8*105 МЕ/мл, то доктор должен пересмотреть схему лечения и выбрать более подходящую. Соответственно, чем больше уровень, тем сильнее вирус поразил организм и хуже прогноз.

При гепатите В нормами ПЦР выступают следующие значения вирусной нагрузки (виремии), копий/мл:

Зная количественно, как ведет себя вирус в организме, можно определить форму заболевания (хроническая, острая или носительство), необходимость проведения дополнительных исследований, реакцию организма и вируса на лечение:

  1. Хронический гепатит б диагностируется, если значение трансаминазы будет выше нормы, активность вируса — больше 4, а концентрация ДНК-копий в миллилитре крови составит 10^5 копий.
  2. Носительство определяется по следующей картине, которую дают результаты — концентрация < 10^5 копий/мл, а уровень трансаминазы равен стандартному значению.
  3. Резистентность (устойчивость) при HBV постоянно контролируется во время лечения. Анализы сдаются каждые 3 месяца. Если в один из моментов виремия при гепатите увеличится в 10 раз, то это означает, что ВГВ приспособился к используемым лекарственным препаратам — стал устойчивым.
  4. Благоприятный ход лечения покажет снижение виремии на 85% через 3 дня после начала терапии.
  5. Направление на биопсию печени больной получает лишь тогда, когда показатель АЛТ (аланинаминотрансферазы) превышает нормальное значение не более 2 раз за 6 месяцев, а расшифровка ПЦР на гепатит В показывает виремию > 10^5 копий/мл. Когда же при большой вирусной активности наблюдается повышение уровня АЛТ чаще 2-х раза за полгода, то сразу же назначается антивирусная терапия.

Чтобы узнать, как будет вести себя ДНК гепатит в плане хронизации, то есть перехода к хронической форме из острой, также используются результаты ПЦР-диагностики:

  • ДНК ВГВ < 2 х 10^4 копий/мл означает, что острая стадия не перейдет в хроническую форму;
  • ДНК ВГВ лежит в пределах от 2 х 10^4 до 2 х 10^6 копий/мл означает, что у каждого 4-ого больного ВГВ станет хроническим, то есть хронизация составляет 25-30%;
  • ДНК ВГВ > 2 х 10^6 копий/мл означает, что приобретение хронической формы недуга неизбежно.

При изменениях результатов анализов вне нормы, это может свидетельствовать о возвращении болезни и размножении вируса.

Суть пцр метода

Родоначальником метода ПЦР (полимеразной цепной реакции) считается ученый из Норвегии Х. Клеппе. Он первый стал проводить амплификацию (восстановление) ДНК при помощи короткой цепочки ДНК, то есть синтетического праймера (своеобразной копии).

Однако, ученому не удалось реализовать свою идею. Похожие исследования сделал американский химик К.Муллис, который в 1993 был удостоен Нобелевской премии за свое изобретение. С тех пор ПЦР используют для установления отцовства, диагностики генетических болезней, обнаружения вирусов.

Суть реакции в том, что при помощи ферментов копируется определенный участок ДНК. Скопировать можно только участок, который соответствует заданным параметрам и если он есть в представленном образце. Для запуска реакции применяют следующие компоненты:

  1. Матричная ДНК с участком, подлежащим копированию.
  2. Праймеры, схожие по строению участку ДНК.
  3. Полимераза, то есть фермент, запускающий реакцию. Она должна быть термостабильной, то есть выдерживать перепады температур.
  4. Раствор с определенными параметрами, обеспечивающий прохождение реакции.

Реакция проводится в несколько этапов:

Денатурация (прогревание)  Сначала раствор нагревают, в результате чего цепочки ДНК расходятся. 
Стадия отжига  Раствор остужают, праймеры связываются с одноцепочечной матрицей. 
Этап элонгации  Полимераза создает дочернюю цепь ДНК, достраиваются все фрагменты цепочки. Цепочка может расти до пределов, которые задаются количеством реагентов, затем достигает состояния плато. 

Для обнаружения гепатита в применяют два типа реакции: количественную и качественную.

Заключение

Метод полимеразной цепной реакции является основным и самым информативным для диагностики ВГВ. Он позволяет не просто установить носительство инфекции, но и уточнить этап заболевания, оценить результаты лечения.

Для более точного диагноза применяют качественное и количественное измерение. К недостаткам способа можно отнести вероятность загрязнения, снижение чувствительности и довольно высокую цену.

Для того, чтобы результаты были наиболее достоверными, следует правильно подготовиться к исследованию и проводить его в клинике с соответствующей лицензией и хорошей репутацией.

Смотрите видео о ПЦР:

С этой статьей также читают:
Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Медицинский взгляд на еду
Adblock
detector