Методы исследования в гистологии, цитологии и эмбриологии (часть 1)

1. Методы исследования в гистологии, цитологии и эмбриологии Часть I

Ивановская государственная медицинская академия

Кафедра гистологии, эмбриологии и цитологии

Методы исследования в

гистологии, цитологии и

эмбриологии

Часть I

к.м.н., старший преподаватель М.Р. Гринева


д.м.н., профессор С.Ю. Виноградов

д.м.н., профессор С.В. Диндяев

далее

2. Оглавление

Введение

Методы исследования живых клеток и тканей

Виды гистологических препаратов фиксированных клеток

Изготовление гистологического препарата

Гистологический препарат


Взятие материала

Фиксация материала

Уплотнение материала

Приготовление срезов

Виды микротомов

Окрашивание срезов

Методы окрашивания

Типы красителей

Заключение срезов в консервирующую среду


Методы микроскопии

Световая микроскопия

Устройство светового микроскопа

Техника микроскопирования

Темнопольная микроскопия

Поляризационная микроскопия


Фазово-контрастная микроскопия

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия

Электронная микроскопия

Рекомендуемая литература

назад

далее

Что выявляют во время данного анализа?

Цитологический метод исследования позволяет выявить нарушения в гормональных функциях яичников. А изучение мазков, взятых с влагалищного свода и маточной шейки, позволяет обнаружить онкологические заболевания на ранних стадиях и предраковые состояния.

Кроме того, исследование позволяет выявить рак предстательной железы, мочевого пузыря, желудка, легких и иных органов. Также представляется возможным выявление гистологической формы опухолевого образования, определение распространенности злокачественного образования, распознание метастаз.

Но целью цитологического исследования является не только рак, но и аутоиммунные патологии, воспалительные, вирусные заболевания. При помощи подобного анализа также можно следить за скоростью регенерации тканей.

Главным заболеванием, следы которого ищут путем цитологического исследования – рак. Кроме того, цитология позволяет выявить предраковые состояния и следующие патологии:

  1. Инфаркты.
  2. Патологии ЦНС воспалительного характера.
  3. Зрелость плода (если проводится исследование амниотической жидкости).
  4. Заболевания незлокачественного характера (сердечная недостаточность застойного типа, туберкулез, пневмония).
  5. Присутствие вирусных антигенов и инфекционных агентов в образцах биоматериала.
  6. Процессы воспаления, в том числе различные менингиты.

3. Введение

В современной гистологии, цитологии и эмбриологии применяются

разнообразные методы исследования, позволяющие всесторонне изучать

процессы развития, строения и функции клеток, тканей и органов.

Главными этапами цитологического и гистологического анализа являются


выбор объекта исследования

подготовка его к микроскопированию

применение методов микроскопирования

качественный и количественный анализ изображения

Объектами


исследования

служат

гистологические

изготовленные из живых или фиксированных клеток.

препараты,

оглавление далее

Показания к проведению

Назначить цитологический метод исследования может гинеколог, онколог, хирург, терапевт. Основными показаниями для этого являются:

  • Подозрение на вирусное заражение, раковое заболевание, процесс воспаления. В этом случае исследование необходимо для уточнения предполагаемого диагноза.
  • Подтверждение онкологии при резекции тканей.
  • Отслеживание динамики терапии разнообразных патологий.
  • Контроль терапевтических результатов.
  • Профилактический скрининг.
  • Контроль состояния при наличии возможности рецидива. В обязательном порядке цитологические исследования проводятся после излечения рака.

Чем отличаются цитологический и гистологический метод исследования? Об этом ниже.

Отличие цитологического анализа от гистологического исследования заключается в том, что изучаются клетки, а не срезы тканей. А значит, заключительные выводы делаются на основе изменений, происшедших в ядре, цитоплазме, ядерно-цитоплазменном соотношении, образования комплексов и структур клеток.

Использоваться для исследования может различный биологический материал – все зависит от того, какой орган исследуется.

5. Виды гистологических препаратов фиксированных клеток

Изучение живых клеток и тканей позволяет получить наиболее полную

информацию об их жизнедеятельности – проследить процессы движения,

деления, разрушения, роста, дифференцировки и взаимодействия клеток,


продолжительность их клеточного цикла, реактивные изменения в ответ на

действие различных факторов.

Методы

Прижизненное

в организме (in vivo)

• Вживление прозрачных камер

• Прижизненная микроскопия


• Трансплантация

Прижизненное в культуре

клеток и тканей (in vitro)

• Суспензионные культуры

• Монослойные культуры

• Культивирование in vivo

назад


оглавление далее

• тонкие (толщина

более 1 мкм)

• полутонкие

(толщина менее


1 мкм)

• ультратонкие

(толщина менее

0,1 мкм)

Мазок


• крови

• красного

костного

мозга

• спинномозговой

жидкости

• слюны

• влагалищный


• и др.

Отпечаток

селезенки

тимуса

печени

слизистой

оболочки

мочевого


пузыря

• слизистой

оболочки

щеки

• и др.

назад


Пленка

• брюшины

• плевры

• мягкой мозговой

оболочки

• соединительной


ткани

• и др.

оглавление далее

Биоматериал для исследования

Как правило, цитологический метод исследования (в отличие от гистологического, когда для исследования берутся части тканей, как правило, путем биопсии или их резекции) вмешательства в организм пациента не предполагает: практически все биоматериалы можно получить безболезненным способом. Исследоваться могут:

  1. Соскобы, взятые с язв, эрозированных поверхностей, свищей, ран.
  2. Мазки, смывы с цервикального канала и шейки матки. Цитологический метод исследования здесь используется чаще всего.
  3. Амниотическая жидкость.
  4. Выделения молочных желез.
  5. Секрет из предстательной железы.
  6. Моча.
  7. Мокрота.

Однако сбор некоторых биоматериалов может доставить пациенту неприятные ощущения. Но такая процедура проводится быстро, а чаще всего собрать необходимый материал удается при проведении других исследований, что исключает новые болезненные процедуры.

Инвазивный способ

Инвазивным способом происходит сбор следующих материалов для цитологического метода изучения:

  1. Пунктаты из серозных и суставных полостей (сбор происходит при помощи тонкой иглы).
  2. Цереброспинальная жидкость.
  3. Кровь.
  4. Смывы с различных органов при эндоскопии.

Кроме того, цитологическому исследованию могут подвергаться отпечатки тканей, которые были удалены в ходе операции или взяты с целью гистологического исследования.

Полученные биологические образцы могут исследоваться разными методиками.

Основные методы цитологического исследования

В различных клиниках могут применяться разные способы такого исследования, основными среди которых являются:

  1. Световая микроскопия. В основе такого метода находится анализ при помощи оптического микроскопа. Исследуемый материал должен быть прозрачным или полупрозрачным, чтобы световой луч мог проникать сквозь него. Современные световые микроскопы позволяют увеличить образец в 3 000 раз. Минусом такого метода является то, что он не позволяет исследовать клетки, размер которых менее 200 нм. Световая микроскопия позволяет рассмотреть общий план клетки, процессы ее жизненного цикла. Микроскопия бывает светлых, темных полей, люминесцентной, ультрафиолетовой. Данная методика подходит для анализа разнообразных штаммов бактерий, измененных, опухолевых клеток. Точность метода практически равна 100%.
  2. Электронная микроскопия. Проводится при помощи электронного микроскопа и позволяет получить увеличение исследуемых образцов до 500 000 раз. Кроме того, электронный микроскоп дает результаты высокой четкости (предварительно клетки протравливают специальными веществами). Данная методика дает возможность рассмотреть вирусы, строение мембран клеток, другие микрообъекты, к примеру, рибосомы, взаимодействия антигена и антител.
  3. Центрифугирование. Данная методика используется с целью детального анализа химического состава органелл клеток. Предварительно раздробленные в гомогенизаторе образцы помещают в центрифугу, после чего запускают ее вращение. Органеллы послойно оседают на дне центрифуги. После этого фракции разделяют и изучают клеточные структуры. Именно таким способом удается получить материал для цитохимического исследования.
  4. Методика меченых атомов. Авторадиография дает возможность наблюдения за биохимическими процессами, протекающими в отдельных клетках. Для этого производят замену кислородных, углеродных и других атомов в клетках на радиоактивные изотопы, после чего специальными проборами фиксируют их локализацию, характер поведения, передвижение.
  5. Методика рентгеноструктурного анализа. Необходима для анализа пространственных расположений белковых цепочек, РНК, ДНК в клеточных структурах.
  6. Методика клеточных структур. Предполагает выращивание клеток в питательной среде и их последующее изучение.
  7. Микрохирургическая методика. Предполагает имплантирование или удаление различных органелл из клетки, введение сторонних молекул, искусственный обмен органеллами между клетками.

8. Взятие материала

Изготовление гистологического препарата производится из органов и тканей,

биопсия (пунктат),

операционным путем,


секционный (трупный) материал,

экспериментальный

1. Забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти

или забоя экспериментального животного, а при возможности от живого

объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или

органа.

2. Забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не


травмировать ткани.

3. Толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий

раствор мог проникнуть в толщу кусочка.

4. Обязательно

производится


маркировка

кусочка

(указывается

наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата

забора и так далее).

назад оглавление далее

9. Фиксация материала

Цель фиксации материала – сохранение прижизненного морфологию


клеток и тканей, предотвращение аутолиза и посмертных изменений.

Фиксатор вызывает денатурацию белка и стабилизацию липидов и тем

самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их

прижизненном состоянии.

Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие

жидкости, которые могут быть простыми (формалин, спирты, глутаровый

альдегид, ацетон) и сложными (раствор Карнуа, фиксатор Ценкера и др.).

Фиксация может достигаться также замораживанием (охлаждением в струе


СО2, жидким азотом и др.).

Подбор фиксаторов и продолжительность фиксации индивидуален для

различных органов и тканей и обычно колеблется от 2 до 24 часов.

10. Уплотнение материала

Целью этого этапа является придание исследуемому материалу такой

плотности, которая позволит получить тонкие срезы необходимой толщины.

https://www.youtube.com/watch?v=YM4glcIfrck

Замораживание образца с последующей резкой на замораживающем

микротоме.

Пропитывание уплотняющими средами (парафин, эпоксидные смолы и др.)


Промывка материала проточной водопроводной водой для удаления

фиксатора.

Обезвоживание (дегидратация) материала в спиртах увеличива-ющейся

концентрации (70, 80, 90, 96, абсолютный – 100%).

Удаление спирта и подготовка материала к пропитыванию парафином


обработкой растворителями парафина (ксилол и др.) и смесью парафина и

ксилола (при температуре 37°С)

Заливка в чистый расплавленный парафин (при температуре 56°С).

Охлаждение парафина и формирование блоков.

14. Методы окрашивания

Для изготовления тонких срезов заданной толщины в настоящее время


используются специальные приборы – микротомы (для световой микроскопии)

и ультрамикротомы (для электронной микроскопии).

3-8 мкм из материала, залитого в парафин,

10-25 мкм из материала, замороженного в камере микротома-криостата

0,08-0,1 мкм из материала, подготовленного для электронной микроскопии

Полученные срезы помещают на предметные стекла (для световой


микроскопии) или монтируются на специальные сеточки (для электронной

микроскопии).

Клеточные

структуры

специальной


обработки,

правило,

различимы даже при большом увеличении микроскопа. Они бесцветны и

прозрачны.

Для выявления тканевых компонентов, отдельных клеток, внутриклеточных

структур используют красители – вещества с высоким сродством к различным

компонентам ткани и с определенными цветооптическими свойствами.


Способность тканевых компонентов по-разному окрашиваться зависит от

кислотно-основных (щелочных) свойств веществ, входящих в их состав.

Перед окрашиванием срезы депарафинируют, проводя последовательно

через растворитель парафина (ксилол), спирты нисходящей концентрации (100,

96, 90, 80, 70%) и помещают в воду.

Общегистологические

Специальные

Гистохимические

выявление


общего плана

строения

клеток, тканей,

органов

выявление

специализированных


структур в

клетках и

тканях

анализ

химического

состава клеток


межклеточного

вещества

назад

Импрегнация

выявление

специализированных

структур в

клетках и


тканях

оглавление

далее

Окрашенные гистологические препараты обезвоживаются в спиртах

восходящей концентрации (70, 80, 90, 96, абсолютный – 100%) и

просветвляются в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах.

Для длительного хранения обезвоженный гистологический срез заключают

(монтируют) в прозрачную консервирующую среду (смолу хвойных деревьев –


канадский, пихтовый бальзам, а также в синтетические среды).

На постоянном гистологическом препарате срез ткани располагается на

предметном стекле, сверху закрыт покровным стеклом. Между стеклами

(предметным и покровным) находится заливочная среда, обладающая

коэффициентом преломления световых лучей, близким к таковому у стекла.

12. Виды микротомов

санный


ротационный

криостатный

замораживающий

для экспрессдиагностики,

гистохимии

вибротом

изготовление


парафиновых

срезов

изготовление

серийных

парафиновых

срезов

изготовление

срезов при

температуре


-20°С и ниже

для гистохимии

и иммуноцитохимии

изготовление

срезов фиксированных и

нефиксированных тканей

15. Импрегнация

Метод выявления тканевых структур путем пропитывания объектов

гистологического исследования растворами солей тяжелых и драгоценных


металлов (например, азотнокислое серебро (серебрение), кобальт, хлористое

золото (золочение), кадмий, осмиевым ангидрид и др. ).

Участки ткани, в которых происходит осаждение солей металлов на

гистологических структурах, приобретают черный или бурый цвет в

зависимости от количества и свойств восстановленного металла.

Периферический нерв

(поперечный срез).

Импрегнация оксидом

осмия


Мультиполярный нейрон.

Импрегнация нитратом серебра

Мультиполярные нейроны.

16. Типы общегистологических красителей

основные

основания,

связываясь с

кислотными

соединениями

гистологических


структур, вызывают

обычно их

окрашивание в синефиолетовые цвета

базофилия

метахромазия


нейтральные

кислые

содержат как

основные, так и

кислые красящие


компоненты

соединяясь с

основными

(щелочными)

соединениями

гистологических

структур,


окрашивают их в

цвета красителя

нейтрофилия

оксифилия

назад

оглавление далее

17. Базофилия

Основные (щелочные) красители активно связываются со структурами, которые

содержат кислоты и несут отрицательный заряд – например, ДНК, РНК.


К ним, в частности, относятся гематоксилин, толуидиновый синий, тионин,

метиленовый синий, азуры и др.

Способность окрашиваться основными (щелочными) красителями называется

базофилией (от греч. basis – основа и philia – любовь).

Поэтому структуры, связывающие эти красители, называются базофильными.

В клетке базофилией обладает ядро (вследствие высокого содержания ДНК и РНК),


иногда цитоплазма (при высоком содержании в ней рибосом или гранулярной ЭПС).

Базофильно может окрашиваться межклеточное вещество некоторых тканей – например,

хрящевой.

Базофилия ядра

нейтрофильного гранулоцита.

Окраска по Романовскому-Гимзе.

Увеличение: х630.

назад

оглавление далее

18. Метахромазия

Метахромазия (от греч. meta – изменение и chroma – цвет, краска) – изменение цвета

некоторых основных красителей при их связывании со структурами, обладающими

специфическими химическими свойствами (обычно высокой концентрацией

сульфатированных гликозаминогликанов).

К таким красителям относятся толуидиновый синий, азур II, тионин и др.

Способность метахроматически окрашиваться обладают гранулы базофильных


лейкоцитов, тучных клеток.

Указанные красители окрашивают другие базофильные структуры в тех же тканях в

обычный свойственный им цвет, т.е. ортохроматически (от греч. orthos – правильный и

chroma – краска).

Метахромазия зернистости

базофильного гранулоцита.


Увеличение: х630.

19. Оксифилия

Кислые красители связываются со структурами, имеющими положительный заряд –

например, белки.

К таким красителям относятся эозин, оранж G, эритрозин, пикриновая кислота и др.

Способность окрашиваться кислыми красителями называется оксифилией, или

ацидофилией (от греч. oxys или лат. acidus – кислый и греч. philia – любовь).

Структуры, связывающие

ацидофильными.


красители,

называются

оксифильными

Оксифилия свойственна цитоплазме клеток (особенно при высоком содержании в

ней митохондрий и некоторых белковых секреторных гранул), эритроцитам (благодаря

высокой концентрации в них гемоглобина). Оксифильно окрашивается цитоплазма

кардиомиоцитов, мышечных волокон скелетной мускулатуры, некоторые компоненты

межклеточного вещества (например, коллагеновые волокна).


Оксифилия зернистости

эозинофильного гранулоцита.

Увеличение: х630.

назад

оглавление далее

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Медицинский взгляд на еду
Adblock
detector