Методы окрашивания в цитологии

Жидкостная цитология

Ивановская государственная медицинская академия

Кафедра гистологии, эмбриологии и цитологии

Методы исследования в

гистологии, цитологии и

эмбриологии


Часть I

к.м.н., старший преподаватель М.Р. Гринева

д.м.н., профессор С.Ю. Виноградов

д.м.н., профессор С.В. Диндяев

далее

Изучение живых клеток и тканей позволяет получить наиболее полную

информацию об их жизнедеятельности – проследить процессы движения,

деления, разрушения, роста, дифференцировки и взаимодействия клеток,

продолжительность их клеточного цикла, реактивные изменения в ответ на


действие различных факторов.

Методы

Прижизненное

в организме (in vivo)

• Вживление прозрачных камер

• Прижизненная микроскопия

• Трансплантация

Прижизненное в культуре


клеток и тканей (in vitro)

• Суспензионные культуры

• Монослойные культуры

• Культивирование in vivo

назад

оглавление далее

• тонкие (толщина


более 1 мкм)

• полутонкие

(толщина менее

1 мкм)

• ультратонкие

(толщина менее

0,1 мкм)

Мазок

• крови


• красного

костного

мозга

• спинномозговой

жидкости

• слюны

• влагалищный


• и др.

Отпечаток

селезенки

тимуса

печени

слизистой

оболочки

мочевого

пузыря


• слизистой

оболочки

щеки

• и др.

назад

Пленка

• брюшины

• плевры


• мягкой мозговой

оболочки

• соединительной

ткани

• и др.

оглавление далее

В последние годы, помимо рутинных (классических) цитологических мазков на стекле, для получения качественных монослойных цитологических препаратов используется жидкостная система, как один из методов снижения негативных факторов и недостатков преаналитического этапа.

Введение

В современной гистологии, цитологии и эмбриологии применяются


разнообразные методы исследования, позволяющие всесторонне изучать

процессы развития, строения и функции клеток, тканей и органов.

Главными этапами цитологического и гистологического анализа являются

выбор объекта исследования

подготовка его к микроскопированию

применение методов микроскопирования

качественный и количественный анализ изображения


Объектами

исследования

служат

гистологические

изготовленные из живых или фиксированных клеток.

препараты,

оглавление далее

Клиническая цитология изучает клеточный состав патологических процессов. Она стала неотъемлемой частью клинического обследования животных в практике ветеринарного врача.

Цитологический метод технически прост, быстр, сравнительно дешев, малотравматичен и практически безболезненен, при его использовании доступна любая локализация в организме  животного.

Однако следует отметить, что успех цитологической диагностики, помимо квалификации цитолога, во многом зависит от того, каким образом был получен материал, как он был обработан, и насколько точно было составлено сопроводительное направление с описанием места локализации исследуемого патологического участка.

Преаналитический этап – один из основных этапов, на котором происходит (зачастую неконтролируемое) снижение контроля качества в лабораторной и цитологической диагностике.

Для создания условий по стандартизации преаналитического этапа и обеспечения качества цитологического исследования внедрены современные методы получения материала, подготовки и доставки проб.

2. Оглавление

Введение

Методы исследования живых клеток и тканей


Виды гистологических препаратов фиксированных клеток

Изготовление гистологического препарата

Гистологический препарат

Взятие материала

Фиксация материала

Уплотнение материала

Приготовление срезов

Виды микротомов

Окрашивание срезов


Методы окрашивания

Типы красителей

Заключение срезов в консервирующую среду

Методы микроскопии

Световая микроскопия


Устройство светового микроскопа

Техника микроскопирования

Темнопольная микроскопия

Поляризационная микроскопия

Фазово-контрастная микроскопия

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия

Электронная микроскопия

Рекомендуемая литература

назад


далее

Клеточный блок (cell-block)

Клеточный блок – это агрегация клеточно-тканевых фрагментов (клочков ткани) с последующими изготовлением гистологического среза и окраской, позволяющая производить морфологическую оценку.

Таким образом метод жидкостной цитологии позволяет сохранить тонкоигольный биоптат для гистологического исследования.

Клеточные срезы  интерпретируются по гистологическим критериям: фрагменты тканевых структур, архитектоника ткани, которая облегчает оценку материала по нескольким разделам гистогенеза.

8. Взятие материала

Изготовление гистологического препарата производится из органов и тканей,

биопсия (пунктат),

операционным путем,

секционный (трупный) материал,

экспериментальный


1. Забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти

или забоя экспериментального животного, а при возможности от живого

объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или

органа.

2. Забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не

травмировать ткани.

3. Толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий

раствор мог проникнуть в толщу кусочка.


4. Обязательно

производится

маркировка

кусочка

(указывается

наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата

забора и так далее).


назад оглавление далее

9. Фиксация материала

Цель фиксации материала – сохранение прижизненного морфологию

клеток и тканей, предотвращение аутолиза и посмертных изменений.

Фиксатор вызывает денатурацию белка и стабилизацию липидов и тем

самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их

прижизненном состоянии.

Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие


жидкости, которые могут быть простыми (формалин, спирты, глутаровый

альдегид, ацетон) и сложными (раствор Карнуа, фиксатор Ценкера и др.).

Фиксация может достигаться также замораживанием (охлаждением в струе

СО2, жидким азотом и др.).

Подбор фиксаторов и продолжительность фиксации индивидуален для

различных органов и тканей и обычно колеблется от 2 до 24 часов.

10. Уплотнение материала

Целью этого этапа является придание исследуемому материалу такой

плотности, которая позволит получить тонкие срезы необходимой толщины.


Замораживание образца с последующей резкой на замораживающем

микротоме.

Пропитывание уплотняющими средами (парафин, эпоксидные смолы и др.)

Промывка материала проточной водопроводной водой для удаления

фиксатора.

Обезвоживание (дегидратация) материала в спиртах увеличива-ющейся


концентрации (70, 80, 90, 96, абсолютный – 100%).

Удаление спирта и подготовка материала к пропитыванию парафином

обработкой растворителями парафина (ксилол и др.) и смесью парафина и

ксилола (при температуре 37°С)

Заливка в чистый расплавленный парафин (при температуре 56°С).


Охлаждение парафина и формирование блоков.

14. Методы окрашивания

Для изготовления тонких срезов заданной толщины в настоящее время

используются специальные приборы – микротомы (для световой микроскопии)

и ультрамикротомы (для электронной микроскопии).

3-8 мкм из материала, залитого в парафин,


10-25 мкм из материала, замороженного в камере микротома-криостата

0,08-0,1 мкм из материала, подготовленного для электронной микроскопии

Полученные срезы помещают на предметные стекла (для световой

микроскопии) или монтируются на специальные сеточки (для электронной

микроскопии).

Клеточные

структуры

специальной

обработки,

правило,

различимы даже при большом увеличении микроскопа. Они бесцветны и

прозрачны.

Для выявления тканевых компонентов, отдельных клеток, внутриклеточных

структур используют красители – вещества с высоким сродством к различным


компонентам ткани и с определенными цветооптическими свойствами.

Способность тканевых компонентов по-разному окрашиваться зависит от

кислотно-основных (щелочных) свойств веществ, входящих в их состав.

Перед окрашиванием срезы депарафинируют, проводя последовательно

через растворитель парафина (ксилол), спирты нисходящей концентрации (100,

96, 90, 80, 70%) и помещают в воду.

Общегистологические

Специальные

Гистохимические


выявление

общего плана

строения

клеток, тканей,

органов

выявление

специализированных


структур в

клетках и

тканях

анализ

химического


состава клеток

межклеточного

вещества

назад

Импрегнация


выявление

специализированных

структур в

клетках и

тканях

оглавление

далее

Окрашенные гистологические препараты обезвоживаются в спиртах

восходящей концентрации (70, 80, 90, 96, абсолютный – 100%) и


просветвляются в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах.

Для длительного хранения обезвоженный гистологический срез заключают

(монтируют) в прозрачную консервирующую среду (смолу хвойных деревьев –

канадский, пихтовый бальзам, а также в синтетические среды).

На постоянном гистологическом препарате срез ткани располагается на

предметном стекле, сверху закрыт покровным стеклом. Между стеклами


(предметным и покровным) находится заливочная среда, обладающая

коэффициентом преломления световых лучей, близким к таковому у стекла.

12. Виды микротомов

санный

ротационный

криостатный

замораживающий


для экспрессдиагностики,

гистохимии

вибротом

изготовление

парафиновых

срезов


изготовление

серийных

парафиновых

срезов

изготовление

срезов при

температуре


-20°С и ниже

для гистохимии

и иммуноцитохимии

изготовление

срезов фиксированных и

нефиксированных тканей

15. Импрегнация

Метод выявления тканевых структур путем пропитывания объектов

гистологического исследования растворами солей тяжелых и драгоценных


металлов (например, азотнокислое серебро (серебрение), кобальт, хлористое

золото (золочение), кадмий, осмиевым ангидрид и др. ).

Участки ткани, в которых происходит осаждение солей металлов на

гистологических структурах, приобретают черный или бурый цвет в

зависимости от количества и свойств восстановленного металла.

Периферический нерв

(поперечный срез).

Импрегнация оксидом


осмия

Мультиполярный нейрон.

Импрегнация нитратом серебра

Мультиполярные нейроны.

16. Типы общегистологических красителей

основные

основания,

связываясь с


кислотными

соединениями

гистологических

структур, вызывают

обычно их

окрашивание в синефиолетовые цвета


базофилия

метахромазия

нейтральные

кислые

содержат как


основные, так и

кислые красящие

компоненты

соединяясь с

основными

(щелочными)


соединениями

гистологических

структур,

окрашивают их в

цвета красителя

нейтрофилия

оксифилия

назад

оглавление далее

17. Базофилия

Основные (щелочные) красители активно связываются со структурами, которые

содержат кислоты и несут отрицательный заряд – например, ДНК, РНК.

К ним, в частности, относятся гематоксилин, толуидиновый синий, тионин,

метиленовый синий, азуры и др.

Способность окрашиваться основными (щелочными) красителями называется

базофилией (от греч. basis – основа и philia – любовь).

Поэтому структуры, связывающие эти красители, называются базофильными.


В клетке базофилией обладает ядро (вследствие высокого содержания ДНК и РНК),

иногда цитоплазма (при высоком содержании в ней рибосом или гранулярной ЭПС).

Базофильно может окрашиваться межклеточное вещество некоторых тканей – например,

хрящевой.

Базофилия ядра

нейтрофильного гранулоцита.


Окраска по Романовскому-Гимзе.

Увеличение: х630.

назад

оглавление далее

18. Метахромазия

Метахромазия (от греч. meta – изменение и chroma – цвет, краска) – изменение цвета

некоторых основных красителей при их связывании со структурами, обладающими


специфическими химическими свойствами (обычно высокой концентрацией

сульфатированных гликозаминогликанов).

К таким красителям относятся толуидиновый синий, азур II, тионин и др.

Способность метахроматически окрашиваться обладают гранулы базофильных

лейкоцитов, тучных клеток.

Указанные красители окрашивают другие базофильные структуры в тех же тканях в


обычный свойственный им цвет, т.е. ортохроматически (от греч. orthos – правильный и

chroma – краска).

Метахромазия зернистости

базофильного гранулоцита.

Увеличение: х630.

19. Оксифилия

Кислые красители связываются со структурами, имеющими положительный заряд –

например, белки.

К таким красителям относятся эозин, оранж G, эритрозин, пикриновая кислота и др.


Способность окрашиваться кислыми красителями называется оксифилией, или

ацидофилией (от греч. oxys или лат. acidus – кислый и греч. philia – любовь).

Структуры, связывающие

ацидофильными.

красители,

называются


оксифильными

Оксифилия свойственна цитоплазме клеток (особенно при высоком содержании в

ней митохондрий и некоторых белковых секреторных гранул), эритроцитам (благодаря

высокой концентрации в них гемоглобина). Оксифильно окрашивается цитоплазма

кардиомиоцитов, мышечных волокон скелетной мускулатуры, некоторые компоненты

межклеточного вещества (например, коллагеновые волокна).


Оксифилия зернистости

эозинофильного гранулоцита.

Увеличение: х630.

назад

оглавление далее

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Медицинский взгляд на еду
Adblock
detector