Методы в современной цитологии

28. Фракционирование клеток

Современные методы

исследования

Галилео-Галилей (1564-1642)

(итальянский философ, математик, физик

и астроном, оказавший значительное

влияние на науку своего времени;


изобретатель микроскопа)

Один из первых

микроскопов

(1876)

Микроскоп Левенгука


Микроскоп Гука

Микроскоп

как предмет роскоши

С середины ХХ века цитологи получили возможность исследовать не

только целые клетки, но и отдельные органоиды, выделенные из клеток в

жизнеспособном состоянии.

Для этого используется метод фракционирования клеток, основанный на

дифференциальном центрифугировании.

Центрифуга

Разные органоиды осаждаются на дно

пробирки при разных скоростях

центрифугирования.

Скорость оседания зависит от размера

частицы и ее плотности.

При низких скоростях

центрифугирования в первую очередь


осаждаются ядра. Получив осадок ядер,

оставшуюся суспензию переливают в

другую пробирку для следующего этапа

центрифугирования. Осадок, состоящий

из клеточных ядер, размешивают и

используют в экспериментальной работе.


Так повторяют несколько раз, увеличивая

скорость и продолжительность

центрифугирования. Самые высокие

скорости центрифугирования

необходимы для получения самых

маленьких органелл – рибосом.

Метод фракционирования

С помощью этого метода впервые в


клетках были открыты лизосомы –

небольшие вакуоли, содержащие

гидролитические ферменты и

выполняющие пищеварительные

функции в клетках. После открытия

лизосом методом фракционирования, их

обнаружили на срезах клеток под


световым и электронным микроскопом с

помощью метода цитохимии, выявив

работу специфических ферментов.

Возможность получения чистых фракций

отдельных органоидов позволила изучить их

химический состав, набор ферментов и, в

конечном итоге, понять, как работает та или


иная клеточная структура.

Метод авторадиографии

Метод авторадиографии используют для выяснения, в

каких местах в клетке идет синтез тех или иных полимерных

молекул, для изучения, куда переносятся синтезированные

вещества.

Иначе метод называют радиоавтографией.

Этот метод может использоваться применительно и к


световой, и к электронной микроскопии.

Метод позволяет обнаруживать в клетке биологические

полимерные молекулы, меченые радиоактивными

изотопами.

Ядра радиоактивных изотопов нестабильны, подвергаются

распаду, испуская заряженные частицы или γ-лучи.

Экспериментатор регистрирует этот радиоактивный распад

на фотопленке.

5. Современный световой микроскоп

1665 г – монография «Микрография»,


где описаны его микроскопические и

телескопические наблюдения

Роберт Гук

(1635-1703)

КЛЕТКА КАК ЧУДО ИНЖЕНЕРИИ ПРИРОДЫ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ШКАЛА РАЗРЕШАЮЩЕЙ

СПОСОБНОСТИ НЕВООРУЖЕННОГО ГЛАЗА, СВЕТОВОГО

И ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПОВ

УСТРОЙСТВО И ПРИНЦИП РАБОТЫ МИКРОСКОПА


1. Механическая часть

1.1. Корпус

1.2. Механический

(предметный) столик

1.3. Бинокулярная насадка

1.4. Фокусировочный

механизм

2. Осветительная система

2.1. Источник света


2.2. Коллектор

2.3. Конденсор

3. Оптическая часть

3.1. Объективы

3.2. Окуляры

Современный световой микроскоп

Осветительная система светового

Ход лучей в стандартном микроскопе

источник


света

образец

окуляр

объектив

глаз

конденсор

Ход лучей в современном микроскопе

методы в современной цитологии

коллектор


источник

света

конденсор

образец

окуля

объектив

изображение


образца

РАЗРЕШЕНИЕ МИКРОСКОПА

Разрешение микроскопа по полю – минимальное расстояние между двумя точками

формируемого им изображения, пока они еще видны раздельно.

света,

2 n sin / 2

l – длина волны используемого

Методы в современной цитологии

n – показатель преломления среды,


– угол раскрытия объектива.

коллектор

источник

света

конденсор

объектив окуля

изображение

образца


образец

d 0,61

NA – численная апертура объектива, равная n sin( /2).

Разрешение микроскопа по глубине – глубина фокуса.

4 n 1 1

МИКРОСКОП КАК ДИФРАКЦИОННЫЙ ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЬ

Дифракция лазерного луча с длиной волны 650 нм,

прошедшего через отверстие диаметром 0,2 мм

F (u )


f ( x )[cos( 2 xu) i sin( 2 xu)]dx

Прямое преобразование Фурье

f ( x)

F (u )[cos( 2 xu) i sin( 2 xu)]du

Обратное преобразование Фурье

Закон масштаба, который гласит, что чем меньше размеры объекта, тем больше


размеры его диффракционной картины

МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ

метод светлого поля в проходящем свете

метод косого поля

метод светлого поля в отраженном свете

Методы в современной цитологии

2) Метод темного поля

3) Метод фазового контраста

4) Метод поляризационной микроскопии

5) Метод интерференционной микроскопии


6) Метод флуоресцентной микроскопии

7) Метод люминисцентной микроскопии

8) Метод электронной микроскопии

сканирующая электронная микроскопия

Методы современной цитологии

Цитохимия

Методы основанные на


использовании

специфических красителей

(судан черный)

Проведение химической реакции на

срезе на предметном стекле (реакция


Фельгена на выявление ДНК)

17. Методы современной цитологии Иммуноцитохимия

С помощью цитохимических цветных реакций в клетках выявляют

полисахариды,

специфические аминокислоты в белках,

Цитология – наука о клетке

нуклеиновые кислоты,

жиры,


липиды

и множество ферментов, участвующих в метаболических

процессах обмена и превращения веществ.

Ферменты обычно выявляют по наличию продуктов их активности.

Новое направление цитохимии –

иммуноцитохимия,


в настоящее время является

одним из самых передовых

методов клеточной биологии.

Для этого метода используются

люминисцентные микроскопы.

Разрешение таких микроскопов

соответствует световым.

Их особенность в том, что


препарат освещается снизу не

пучком видимого света, а

ультрафиолетовым лучом

определенной длины волны.

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИИ


Устройство

флуоресцентного микроскопа

Упрощенная схема хода

лучей во флуоресцентном

микроскопе


Возможности технологии флуоресцентной микроскопии и не только

Иммуноцитохимия

Другая особенность метода в том, что

используются не обычные,

а люминисцентные, или флюоресцентные

красители для окрашивания препаратов.

Такие красители под воздействием

ультрафиолета дают яркое свечение.

Исследователь видит препарат на темном фоне,


где ярко светятся окрашенные участки клеток.

Культура стромальных стволовых клеток человека.

Зеленым флюоресцирует цитоплазма, содержащая

нестин, синим — ядерный материал.

красным цветом флуоресцирует ДНК клеток, зеленым – клеточная

стенка и цитоплазма с содержащимися в ней пластидами.

С помощью метода иммуноцитохимии изучили

состав и расположение элементов цитоскелета клеток

растений и животных,

какие особенности цитоскелета характерны для опухолевых

клеток.


С помощью этого метода научились выявлять

индивидуальность хромосом человека,

что необходимо при изучении развития патологий, а так же в

судебной медицине.

Метод иммуноцитохимии


позволил выявить на поверхности

разнообразных клеток свои

индивидуальные маркеры, что

облегчило понимание многих

патологических процессов,

Методы в современной цитологии

позволило выяснить, какие

клеточные типы являются


отправной точкой в развитии ряда

болезней.

Например, показана роль

макрофагов и гладкомышечных

клеток кровеносных сосудов в

развитии атеросклероза.

17. Методы современной цитологии Иммуноцитохимия

иммуноцитохимия,

Устройство


микроскопе

Иммуноцитохимия

клеток.

судебной медицине.

болезней.

32. Метод авторадиографии

Авторадиограмма,


показывающая распределение

фосфора в листьях томата

Включение в ядра

соединительнотканных клеток

меченного тритием тимина

(Н3-Т)

Именно методом авторадиографии было показано,

ДНК всегда находится в ядре и никуда оттуда не


выходит.

РНК, напротив, синтезируется в ядре, а затем

выходит в цитоплазму.

Белок никогда не синтезируется в ядре.

Место синтеза белка – рибосомы цитоплазмы.

Отсюда белок может перемещаться и в ядро, и

внутрь органелл цитоплазмы.

Метод клеточных культур

Для получения клеточной культуры небольшие кусочки ткани

диссоциируют на отдельные клетки, используя ферментативную и

механическую обработку, и получают суспензию клеток.

стеклянные или пластиковые, и заливают искусственной питательной

средой.


Для каждого типа клеток среда индивидуальна.

Для большинства животных клеток питательная среда имеет в своем

составе глюкозу, незаменимые аминокислоты, витамины и небольшой

процент сыворотки крови.

Важно поддерживать нейтральную реакцию среды, оптимальную

температуру, не допускать инфекционного заражения.

Именно с помощью метода клеточных культур впервые были описаны особенности опухолевых

клеток.

Первая особенность – способность к бесконечному делению.


В 50-ые годы ХХ века была получена перевиваемая клеточная культура раковых клеток опухоли

молочной железы.

Культура получила название HeLa по инициалам оперированной пациентки. Эти клетки живы до

сих пор, и с ними работают во многих лабораториях мира. За прошедшие годы ученые вырастили

тонны этих клеток, хотя самой пациентки давно уже нет.


Другая особенность раковых клеток – отсутствие контактного торможения. Они не прекращают

делиться, заполняя всю поверхность сосуда. Клетки наползают друг на друга, могут образовывать

второй и третий слой.

Ослабленным контактным торможением характеризуются

раковые клетки


Раковые клетки продолжают расти и

после того, как заполнят всю поверхность

субстрата, образуя мультислой.

Методы в современной цитологии

Нетрансформированные

нормальные

клетки могут

делиться

ограниченное


количество раз.

Микрофотография

(сканирующий электронный

эпидермальная карцинома

Световая микроскопия

человека. Стрелками показаны

места «наползания» клеток друг

на друга

Клеточная терапия болезней


миокарда

1. Оплодотворенная яйцеклетка (зигота)

2. Зигота делится надвое

3—4. Митотическое деление

продолжается

5. Через 5 дней образуется бластоциста


— шарик из клеток, наружный слой

которого должен дать начало плаценте,

а внутренний — всем тканям нового

организма

6. Внутреннюю часть бластоцисты

помещают на питательную среду


7. Используя разные химические

сигналы, стволовые клетки превращают

в клетки разных тканей: мышечные,

эпителиальные, костного мозга и другие

8. Клетки — предшественники миоцитов

(клеток сердечной мышцы) впрыскивают

вблизи очага поражения, чтобы они

устранили дефект

38. Дифференциация адвентивных почек в каллусной ткани

Через каллусную культуру

успешно размножаются

сахарная свекла, злаковые

капустные, подсолнечник и

другие культуры.

Растениерегенерант твердой


пшеницы

Каллус — особая ткань,

состоящая из недифференцированных

клеток

Каллус на


питательной среде

39. Культуры in vitro тканей растений органогенез

Дифференциация побегов из каллуса

яблоня

Микроклональное размножение –

размножение растений in vitro, «в

пробирке».


Его преимущество перед другими способами

получение генетически однородного посадочного материала;

освобождение растений от вирусов; высокий коэффициент

размножения (от 104 для хвойных до 106 — для травянистых

растений);

сокращение продолжительности селекционного процесса;

ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной

фазе развития;

размножение растений, трудно размножаемых традиционными


способами;

возможность проведения работ в течение всего года;

возможность автоматизации процесса выращивания.

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Медицинский взгляд на еду
Adblock
detector