Методы цитологических исследований микроскопия

Общие сведения

Окислительное
фосфорилирование, синтез АТФ из
аденозиндифосфата и неорганического
фосфата, осуществляющийся в живых
клетках, благодаря энергии, выделяющейся
при окислении орг. веществ в процессе
клеточного дыхания.

Разобщение
ОФ и его значение

Некоторые
химические вещества (протонофоры) могут
переносить протоны или другие ионы
(ионофоры) из межмембранного пространства
через мембрану в матрикс, минуя протонные
каналы АТФ-синтазы.

В результате этого
исчезает электрохимический потенциал
и прекращается синтез АТФ. Это явление
называют разобщением дыхания и
фосфорилирования. В результате разобщения
количество АТФ снижается, а АДФ
увеличивается.

В этом случае скорость
окисления NADH и FADH2 возрастает,
возрастает и количество поглощённого
кислорода, но энергия выделяется в виде
теплоты, и коэффициент Р/О резко снижается.

Как правило, разобщители — липофильные
вещества, легко проходящие через липидный
слой мембраны. Одно из таких веществ —
2,4-динитрофенол (рис. 6-17), легко переходящий
из ионизированной формы в неионизированную,
присоединяя протон в межмембранном
пространстве и перенося его в матрикс.

Лихорадка
и гипертермия

Лихорадка — 
защитная реакция организма направленная,
как правило, на борьбу с чужеродным
фактором. Усиление окисления сопровождается
усилением фосфорилирования – достигается
дополнительный приток энергии.

Гипертермия –
пагубный процесс, сопровождающийся
разобщением процессов окисления и
фосфорилирования – перегрев организма
не сопровождающийся накоплением
дополнительной энергии.

1)
прокариотический, 2) эукариотический.

Общим
для клеток обоих типов является то, что
клетки ограничены оболочкой, внутреннее
содержимое представлено цитоплазмой.
В цитоплазме находятся органоиды и
включения.

Органоиды —
постоянные, обязательно присутствующие,
компоненты клетки, выполняющие
специфические функции. Органоиды могут
быть ограничены одной или двумя мембранами
(мембранные органоиды) или не ограничены
мембранами (немембранные
органоиды).

В
таблице перечислены основные различия
между прокариотическими и эукариотическими
клетками.

Признак

Прокариотические
клетки

Эукариотические
клетки

Структурно
оформленное ядро

Отсутствует

Имеется

Генетический
материал

Кольцевые
не связанные с белками ДНК

Линейные
связанные с белками ядерные ДНК и
кольцевые не связанные с белками ДНК
митохондрий и пластид

Мембранные
органоиды

Отсутствуют

Имеются

Рибосомы

70-S
типа

80-S
типа (в митохондриях и пластидах —
70-S типа)

Жгутики

Не
ограничены мембраной

Ограничены
мембраной, внутри микротрубочки: 1
пара в центре и 9 пар по периферии

Основной
компонент клеточной стенки

Муреин

У
растений — целлюлоза, у грибов — хитин

Строение
растительной клетки.

  • Есть
    пластиды;

  • Автотрофный
    тип питания;

  • Синтез
    АТФ происходит в хлоропластах и
    митохондриях;

  • Имеется
    целлюлозная клеточная стенка;

  • Крупные
    вакуоли;

  • Клеточный
    центр только у низших.

Строение
животной клетки.

  • Пластиды
    отсутствуют;

  • Гетеротрофный
    тип питания;

  • Синтез
    АТФ происходит в митохондриях;

  • Целлюлозная
    клеточная стенка отсутствует;

  • Вакуоли
    мелкие;

  • Клеточный
    центр есть у всех клеток.

Сходства

  • Принципиальное единство строения
    (поверхностный аппарат клетки,
    цитоплазма, ядро.)

  • Сходство
    в протекании многих химических процессов
    в цитоплазме и ядре.

  • Единство
    принципа передачи наследственной
    информации при делении клетки.

  • Сходное
    строение мембран.

  • Единство
    химического состава.

Органеллы
общего назначения: эндоплазматическая
сеть: гладкая, шероховатая; комплекс
Гольджи, митохондрии, рибосомы, лизосомы
(первичные, вторичные), клеточный центр,
пластиды (хлоропласты, хромопласты,
лейкопласты);.

Органеллы
специального назначения: жгутики,
реснички, миофибриллы,
нейрофибриллы; включения (непостоянные
компоненты клетки): запасные, секреторные,
специфические.

Главные
органоиды

Строение

Функции

Цитоплазма

Внутренняя
полужидкая среда мелкозернистой
структуры. Содержит ядро и органоиды

  1. Обеспечивает
    взаимодействие ядра и органоидов

  2. Регулирует
    скорость биохимических процессов

  3. Выполняет
    транспортную функцию

ЭПС
— эндоплазматическая сеть

Система
мембран в цитоплазме» образующая
каналы и более крупные полости, ЭПС
бывает 2-х типов: гранулированная
(шероховатая), на которой расположено
множество рибосом, и гладкая

  1. Осуществляет
    реакции, связанные с синтезом белков,
    углеводов, жиров

  2. Способствует
    переносу и циркуляции питательных
    веществ в клетке

  3. Белок
    синтезируется на гранулированной
    ЭПС, углеводы и жиры — на гладкой
    ЭПС

Рибосомы

Мелкие
тельца диаметром 15—20 мм

Осуществляют
синтез белковых молекул, их сборку из
аминокислот

Митохондрии

Имеют
сферическую, нитевидную, овальную и
другие формы. Внутри митохондрий
находятся складки (дл. от 0,2 до 0,7 мкм).
Внешний покров митохондрий состоит
из 2-х мембран: наружная — гладкая, и
внутренняя — образует выросты-кресты,
на которых расположены дыхательные
ферменты

  1. Обеспечивают
    клетку энергией. Энергия освобождается
    при распаде аденозинтрифосфорной
    кислоты (АТФ)

  2. Синтез
    АТФ осуществляется ферментами на
    мембранах митохондрий

Пластиды
— свойственны только клеткам раститений,
бывают трех типов:

Двумембранные
органеллы клетки

хлоропласты

Имеют
зеленый цвет, овальную форму, ограничены
от цитоплазмы двумя трехслойными
мембранами. Внутри хлоропласта
располагаются грани, где сосредоточен
весь хлорофилл

Используют
световую энергию солнца и создают
органические вещества из неорганических

хромопласты

Желтые,
оранжевые, красные или бурые, образуются
в результате накопления каротина

Придают
различным частям растений красную и
желтую окраску

лейкопласты

Бесцветные
пластиды (содержатся в корнях, клубнях,
луковицах)

В
них откладываются запасные питательные
вещества

Комплекс
Гольджи

Может
иметь разную форму и состоит из
отграниченных мембранами полостей и
отходящих от них трубочек с пузырьками
на конце

  1. Накапливает
    и выводит органические вещества,
    синтезируемые в эндоплазматической
    сети

  2. Образует
    лизосомы

Лизосомы

Округлые
тельца диаметром около 1 мкм. На
поверхности имеют мембрану (кожицу),
внутри которой находится комплекс
ферментов

Выполняют
пищеварительную функцию — переваривают
пищевые частицы и удаляют отмершие
органоиды

Органоиды
движения клеток

  1. Жгутики
    и реснички, представляющие из себя
    выросты клетки и имеющие однотипное
    строение у животных и растений

  2. Миофибриллы
    — тонкие нити длиной более 1 см
    диаметром 1 мкм, расположенные пучками
    вдоль мышечного волокна

  3. Псевдоподии

  1. Выполняют
    функцию движения

  2. За
    счет их происходит сокращение мышц

  3. Передвижение
    за счет сокращения особого сократительного
    белка

Клеточные
включения

Это
непостоянные компоненты клетки —
углеводы, жиры и белки

Запасные
питательные вещества, используемые
в процессе жизнедеятельности клетки

Клеточный
центр

Состоит
из двух маленьких телец — центриолей
и центросферы — уплотненного участка
цитоплазмы

Играет
важную роль при делении клеток

Наиболее
популярна в настоящее время симбиотическая
гипотеза происхождения
эукариотических клеток, согласно которой
основой, или клеткой-хозяином, в эволюции
клетки эукариотического типа
послужил анаэробный
прокариот, способный
лишь к амебоидному движению.

Переход к
аэробному дыханию связан с наличием в
клетке митохондрии, которые произошли
путем изменений симбионтов — аэробных
бактерий, проникших в клетку-хозяина и
сосуществовавших с ней.

Согласно инвагинационной
гипотезе, предковой
формой эукариотической клетки был аэробный
прокариот (рис.
1.4). Внутри такой клетки-хозяина находилось
одновременно несколько геномов,
первоначально прикреплявшихся к
клеточной оболочке.

Органеллы, имеющие
ДНК, а также ядро, возникли путем
впячивания и отшнуровывания участков
оболочки с последующей функциональной
специализацией в ядро, митохондрий,
хлоропласты.

Современные методы микроскопического исследования используют в своей практике разные специалисты. Среди них вирусологи, цитологи, гематологи, морфологи и прочие.

Основные методы микроскопического исследования известны достаточно давно. В первую очередь это световой способ рассмотрения объектов. В течение последних лет активно вводятся в практику и другие технологии.

Так, популярность приобрели фазово-контрастный, люминесцентный, интерференционный, поляризационный, инфракрасный, ультрафиолетовый, стереоскопический метод исследования.

Все они базируются на разнообразных свойствах света. Кроме этого, широко используются электронно-микроскопические методы исследования. Эти способы позволяют отобразить объекты с помощью направленного потока заряженных частиц.

Стоит отметить, что такие приемы изучения применяются не только в биологии и медицине. Достаточно популярен микроскопический метод исследования металлов и сплавов в промышленности.

Цитохимические и гистохимические исследования

Для изучения содержимого клетки, особенностей ее молекулярного состава обычно применяются цитохимические и гистохимические методы исследования. Давно известно, что некоторые химические реакции непосредственно могут выявлять содержание определенных веществ или их отсутствие в клетке.

Например, с успехом применяется реакция Фельтена, приводящая к окрашиванию молекул ДНК в пурпурный цвет. Эта реакция позволяет не только определить с большой точностью локализацию ДНК, но и измерить ее количество. Существуют специальные реакции на отдельные аминокислоты, ферменты и др.

Для выяснения локализации и перемещения веществ в клетке широко используют метод радиоавтографии. В этом случае в питательную среду клеток вводится какое-либо вещество, например аминокислота, нуклеотид, жирная кислота или другое вещество, один из атомов которого (углерод, водород и др.

) замешен радиоактивным изотопом. Клетка поглощает меченые вещества и включает их в собственные биополимеры, а затем их локализация, перемещение и участие в метаболических процессах регистрируется по радиоактивным меткам.

Аноптральный способ

Такие микроскопические методы исследования микроорганизмов и других объектов базируются на различной разрешающей способности оборудования. Немаловажными факторами при этом является направленность луча, особенности самого объекта.

Последний, в частности, может быть прозрачным или непрозрачным. В соответствии со свойствами объекта, меняются физические свойства светового потока – яркость и цвет, обусловленные амплитудой и длиной волны, плоскость, фаза и направленность распространения волны.

Он является разновидностью фазово-контрастного метода. Аноптральный способ предполагает использование объектива со специальными пластинками, которые меняют только цвет и яркость фонового света.

Это существенно расширяет возможности изучения неокрашенных живых объектов. Применяется фазово-контрастный микроскопический метод исследования в микробиологии, паразитологии при изучении растительных и животных клеток, простейших организмов.

Все исследования структуры клеток проводятся с использованием увеличительных приборов. Основным прибором в биологии служит микроскоп. Он представляет собой оптическую систему, главной характеристикой которой является разрешающая способность, выражающая минимальное расстояние между двумя точками, видимыми раздельно.

Разрешение микроскопа зависит от длины волны – чем она меньше, тем меньшего размера объект можно рассмотреть. Разрешающая способность самого современного светового микроскопа соответствует примерно половине длины световой волны.

Обычно в световых микроскопах используются источники освещения в видимой области спектра (400–700 нм), в этом случае разрешающая способность может быть не выше 200–350 нм (0,2 – 0,35 мкм).

Если использовать ультрафиолетовый свет (260–280 нм), то можно повысить разрешение до 130–140 нм (0,13 – 0,14 мкм). Иногда в световом микроскопе можно увидеть частицы еще меньшей величины за счет их светопреломляющих свойств.

Важно отметить, что световой микроскоп позволяет видеть живые клетки. В качестве объектов можно использовать свободноживущие клетки простейших и других одноклеточных организмов, клетки крови или же разобщенные тканевые клетки многоклеточных организмов как животного, так и растительного происхождения.

При изучении живых клеток их окрашивают с помощью так называемых витальных красителей. Широко используются также флуоресцирующие красители и метод флуоресцентной микроскопии.

Суть его заключается в том, что некоторые вещества способны светиться (флуоресцировать, люминесцировать) при поглощении ими световой энергии. Например, хлорофилл при освещении ультрафиолетовыми лучами светится красным цветом, витамины A и B2 – желто-зеленым, собственной флуоресценцией обладают некоторые бактериальные пигменты, гормоны.

Метод флуоресцентной микроскопии состоит в следующем: к клеткам добавляют флуоресцирующие красители – флуорохромы, которые избирательно связываются с нуклеиновыми кислотами, липидами, слизью, кератином и др.

Часто флуорохромы присоединяют к различным антителам. Например, если ввести меченые антитела к белку, образующему микротрубочки, то с помощью флуоресцентного микроскопа можно с успехом наблюдать микротрубочки в живых клетках.

Специфика

Для изучения световыми способами объекты, как правило, окрашивают. Это позволяет выявить и описать те или иные их свойства. При этом необходимо, чтобы ткани были фиксированными, поскольку окраска выявит определенные структуры исключительно в убитых клетках.

В живых элементах краситель обосабливается в виде вакуоли в цитоплазме. Она не прокрашивает структуры. Но с помощью светового микроскопа можно исследовать и живые объекты.

16. Что такое органеллы? Какова их роль в клетке? Классификация органелл.

Органеллы
— постоянные внутриклеточные структуры,
имеющие определенное строение и
выполняющие соответствующие функции.
Органеллы делятся на две группы:
мембранные и немембранные.

Мембранные
органеллы представлены двумя вариантами:
двумембранным
и одномембранным.
Двумембранными
компонентами являются пластиды,
митохондрии и клеточное ядро.

К
одномембранным
относятся органеллы вакуолярной системы
— эндоплазматический рети-кулум,
комплекс Гольджи, лизосомы, вакуоли
растительных и грибных клеток, пульсирующие
вакуоли и др.

К немембранным
органеллам
принадлежат рибосомы и клеточный центр,
постоянно присутствующие в клетке.
Выраженность элементов цитоскелета
(постоянного компонента клетки) может
значительно меняться в течение клеточного
цикла — от полного исчезновения одного
компонента (например, цитоплазматических
трубочек во время деления клетки) до
появления новых структур (веретена
деления).

Общим
свойством мембранных органелл является
то, что все они построены из липопротеидных
пленок (биологических мембран),
замыкающихся сами на себя так, что
образуются замкнутые полости, или
отсеки. Внутреннее содержимое этих
отсеков всегда отличается от гиалоплазмы.

Двумембранные
органеллы.
К двумебранным органеллам относятся
пластиды и митохондрии. Пластиды
—характерные органеллы клеток автотрофных
эукариотических организмов.

Пластиды
— органоиды, присущие только растительным
клеткам. Обычно это крупные тельца,
хорошо видимые под световым микроскопом.

Различают
3 типа пластид: бесцветные — лейкопласты,
зеленые — хлоропласты, окрашенные в
другие цвета — хромопласты

Хлоропласты —
зеленые пластиды, содержащие зеленый
пигмент хлорофилл и небольшое количество
каротина и ксантофилла. Главная функция
хлоропластов — фотосинтез, в результате
которого происходит образование богатых
энергией органических веществ.

Синтез
хлорофилла обычно происходит только
на свету, поэтому растения, выращенные
в темноте или при недостатке света,
становятся бледно-желтыми и
называются этиолированными.
Вместо типичных хлоропластов в них
образуются этиопласты.

В
клетках низших растений (водорослей)
хлоропласты крупные и немногочисленные
(один или несколько). Они имеют разнообразную
форму (пластинчатую, звездчатую, ленточную
и др.). Такие хлоропласты
называются хроматофорами.

Хромопласты представляют
собой пластиды, содержащие пигменты из
группы каротиноидов, имеют желтую,
оранжевую или красную окраску. К
каротиноидам относят широко
распространенные каротины (оранжевые)
и ксантофиллы (желтые).

Хромопласты имеют разнообразную форму.
Они образуются в осенних листьях,
корнеплодах (морковь), зрелых плодах и
т.д. В отличие от хлоропластов, форма
хромопластов очень изменчива, но
видоспецифична, что объясняется их
происхождением и состоянием в них
пигментов.

Лейкопласты это
мелкие бесцветные пластиды шаровидной,
яйцевидной или веретеновидной формы.
Они обычно встречаются в клетках органов,
скрытых от солнечного света: в корневищах,
клубнях, корнях, семенах, сердцевине
стеблей и очень редко — в клетках
освещенных частей растения (в клетках
эпидермы). Часто лейкопласты собираются
вокруг ядра, окружая его со всех сторон.

Деятельность
лейкопластов специализирована и связана
с образованием запасных веществ. Одни
из них накапливают преимущественно
крахмал (амилопласты),
другие — белки (протеопласты или алейронопласты),
а третьи — масла (олеопласты).

Изучение неокрашенных объектов

Оно осуществляется с помощью фазово-контрастной микроскопии. Этот способ базируется на дифракции луча в соответствии с особенностями объекта. В процессе воздействия отмечается изменение фазы и длины волны.

В объективе микроскопа присутствует полупрозрачная пластинка. Живые или фиксированные, но не окрашенные объекты из-за своей прозрачности почти не изменяют цвет и амплитуду луча, проходящего сквозь них, провоцируя только сдвиг волновой фазы.

Но при этом, пройдя через объект, световой поток отклоняется от пластинки. В итоге между лучами, пропущенными сквозь объект, и входящими в световой фон, появляется разность волновой длины.

При определенном ее значении возникает визуальный эффект – темный объект будет четко виден на светлом фоне либо наоборот (в соответствии с особенностями фазовой пластинки). Для его получения разность должна составлять не меньше 1/4 длины волны.

Метод фракционирования клеточных структур

Митохондрии
— это органеллы размером с бактерию
(около 1 х 2 мкм). Они найдены в большом
количестве почти во всех эукариотических
клетках. Обычно в клетке содержится
около 2000 митохондрий, общий объем которых
составляет до 25% от общего объема клетки.

Митохондрия ограничена
двумя мембранами — гладкой
внешней и складчатой
внутренней,
имеющей очень большую поверхность.
Складки внутренней мембраны глубоко
входят в матрикс митохондрий, образуя
поперечный перегородки — кристы.

Мембраны
митохондрий содержат интегральные
мембранные белки. Во внешнюю мембрану
входят порины,
которые образуют поры и делают мембраны
проницаемыми для веществ с молекулярной
массой до 10 кДа.

Внутренняя же мембрана
митохондрий непроницаема для большинства
молекул; исключение составляют О2,
СО2,
Н20.
Внутренняя мембрана митохондрий
характеризуется необычно высоким
содержанием белков (75%).

В их число
входят транспортные
белки-переносчики, ферменты,
компоненты дыхательной цепи и АТФ-синтаза.
Кроме того, в ней содержится необычный
фосфолипид кардиолипин.
Матрикс также обогащен белками, особенно
ферментами цитратного цикла.

Главной
функцией митохондрий является захват
богатых энергией субстратов (жирные
кислоты, пируват, углеродный скелет
аминокислот) из цитоплазмы и их
окислительное расщепление с образованием
СО2 и
Н2О,
сопряженное с синтезом АТФ.

1. Обеспечивают
клетку энергией. Энергия освобождается
при распаде аденозинтрифосфорной
кислоты (АТФ)

2. Синтез
АТФ осуществляется ферментами на
мембранах митохондрий

Этот метод позволяет выделить из клеток в чистом виде и большом количестве ядра, различные органоиды и другие компоненты клетки. В его основе лежит различная скорость осаждения (седиментация) частиц разного размера и с разным удельным весом, находящихся в жидкости в виде взвеси.

Для того чтобы все клеточные структуры оказались в одной общей взвеси, клетки предварительно разрушают – гомогенизируют. Затем полученную гомогенную смесь помещают в специальную пробирку и центрифугируют, чтобы ускорить осаждение частиц.

Более крупные и тяжелые частицы первыми оседают на дно, затем оседают более мелкие и легкие. В результате содержимое пробирки разделяется (фракционируется) на несколько разных слоев, каждый из которых содержит одинаковые по плотности органоиды или другие клеточные структуры.

Обычно при первом фракционировании на дне пробирки оказывается ядра и неразрушенные клетки, над ними – смесь органоидов, еще выше – наиболее мелкие фрагменты клеточного содержимого.

Для описания размера органоидов и других компонентов клетки обычно используют так называемый коэффициент седиментации, выражаемый в единицах Сведберга – S.

Например, коэффициент седиментации рибосомы эукариотической клетки составляет 80S, рибосомы бактериальной клетки – 70S. Название этому показателю было дано в честь шведского ученого Теодора Сведберга, лауреата Нобелевской премии, который в 20-х годах XX века впервые предложил использовать для седиментации белков ультрацентрифугу.

23. Ядрышко, его строение и функции. Ядрышковый организатор.

Ядрышко —
самая плотная, структура ядра (D=1-5 мкм)
—производный хроматина. Образует рРНК
и рибосомы. 

Основной
функцией
ядрышка является синтез рибосомных РНК
и рибосом, на которых в цитоплазме
осуществляется синтез полипептидных
цепей. В геноме клетки имеются специальные
участки, так называемые ядрышковые
организаторы, содержащие гены рибосомной
РНК (рРНК), вокруг которых и формируются
ядрышки.

В ядрышке происходит синтез
рРНК РНК полимеразой I, её созревание,
сборка рибосомных субъединиц. В ядрышке
локализуются белки́, принимающие участие
в этих процессах.

Ядрышковый
организатор (nucleolar organizer) [греч. organizo —
сообщаю стройный вид, устраиваю] —
специфический участок хромосомы,
участвующий в образовании ядрышек и
содержащий многочисленные гены, которые
кодируют рРНК. Термин «Я.о.» предложен
Б. Мак-Клинток в 1934 г.

Хромосомы
— это основные структурные элементы
клеточного ядра, являющиеся носителями
генов, в которых закодирована наследственная
информация. Обладая способностью к
самовоспроизведению, хромосомы
обеспечивают генетическую связь
поколений.

Средние
длины метафазных хромосом человека
лежат в пределах 1,5—10 микрон. Химической
основой строения хромосом являются
нуклеопротеиды — комплексы нуклеиновых
кислот (см.) с основными белками —
гистонами и протаминами.

Хромосомы выполняют
функцию
основного генетического аппарата
клетки. В них в линейном порядке
расположены гены, каждый из которых
занимает строго определенное место,
называемое локусом.

Альтернативные
формы гена (т. е. различные его состояния),
занимающие один и тот же локус, называются
аллелями (от греч. allelon — взаимно другой,
иной).

Любая хромосома содержит только
единственный аллель в данном локусе,
несмотря на то, что в популяции могут
существовать два, три и более аллелей
одного гена.

Люминесцентные приемы

Эти микроскопические методы исследования решают в целом те же задачи, что и фазово-контрастные. Однако в последнем случае специалисты могут наблюдать только контуры объектов.

Интерференционные микроскопическиеметоды исследования позволяют изучать их части, выполнять количественную оценку элементов. Это возможно благодаря раздвоению светового луча.

Один поток проходит сквозь частицу объекта, а другой – мимо. В окуляре микроскопа они сходятся и интерферируют. Возникающая разность фаз может определяться по массе разных клеточных структур.

При последовательном ее измерении с заданными показателями преломления можно установить толщину нефиксированных тканей и живых объектов, содержание белков в них, концентрацию сухого вещества и воды и пр.

В соответствии с полученными данными специалисты получают возможность косвенно оценивать проницаемость мембран, активность ферментов, клеточный метаболизм.

Они базируются на свойствах некоторых объектов давать свечение в сине-фиолетовом участке спектра или в УФ-лучах. Многие вещества, например белки, некоторые витамины, коферменты, лекарственные средства, наделены первичной (собственной) люминесценцией.

Другие объекты начинают светиться при добавлении флюорохромов – специальных красителей. Эти добавки избирательно или диффузно распространяются на отдельные клеточные структуры или химические соединения.

Значение поляризации

Сходства

Она осуществляется с помощью призм Николя или пленчатых поляроидов. Их помещают между препаратом и источником света. Поляризационный микроскопический метод исследования в микробиологии позволяет изучать объекты с неоднородными свойствами.

В изотропных структурах быстрота распространения света не зависит от выбранной плоскости. При этом в анизотропных системах скорость изменяется в соответствии с направленностью света по поперечной либо продольной оси объекта.

В случае если величина преломления вдоль структуры будет больше, чем вдоль поперечной, создается двойное положительное лучепреломление. Это свойственно многим биологическим объектам, у которых обнаруживается строгая молекулярная ориентация.

Они все являются анизотропными. К этой категории, в частности, относятся миофибриллы, нейрофибриллы, реснички в мерцательном эпителии, коллагеновые волокна и прочие.

Сравнение характера лучевого преломления и показателя анизотропии объекта дает возможность оценивать молекулярную организацию структуры. Поляризационный метод выступает как один из гистологических способов анализа, используется в цитологии и пр.

В свете можно изучать не только окрашенные объекты. Поляризационный метод дает возможность исследовать неокрашенные и нефиксированные – нативные – препараты тканевых срезов.

Использование ультрафиолета

Применяя иммуно-флуоресценцию, специалисты обнаруживают вирусные антигены и устанавливают их концентрацию, идентифицируют вирусы, анти тела и антигены, гормоны, разнообразные продукты метаболизма и так далее.

В этой связи при диагностике герпеса, эпидемического паротита, вирусного гепатита, гриппа и прочих инфекций используются люминесцентные методы исследования материалов.

Микроскопический иммуно-флуоресцентный способ позволяет распознавать опухоли злокачественного характера, определять ишемические участки в сердце на ранних этапах инфаркта и пр.

Оно основывается на способности ряда веществ, включенных в живые клетки, микроорганизмы или фиксированные, но неокрашенные, прозрачные при видимом свете ткани поглощать УФ-лучи определенной длины волн.

Это характерно, в частности, для высокомолекулярных соединений. К ним относят белки, ароматические кислоты (метилаланин, триптофан, тирозин и пр.), нуклеиновые кислоты, пирамидиновые и пуриновые основания и так далее.

Ультрафиолетовая микроскопия позволяет уточнить локализацию и количество этих соединений. При изучении живых объектов специалисты могут наблюдать изменения процессов их жизнедеятельности.

Дополнительно

Инфракрасная микроскопия используется при исследовании непрозрачных для света и УФ-лучей объектов посредством поглощения их структурами потока, длина волны которого 750-1200 нм.

Чтобы применить этот способ нет необходимости предварительно подвергать препараты химической обработке. Как правило, инфракрасный метод используется в антропологии, зоологии и прочих биологических отраслях.

Что касается медицины, то этот способ применяют преимущественно в офтальмологии и нейроморфологии. Изучение объемных объектов осуществляется с помощью стереоскопической микроскопии.

Конструкция оборудования позволяет выполнять наблюдение левым и правым глазом под различным углом. Непрозрачные объекты исследуются при сравнительно небольшом увеличении (не более 120 раз).

Электронная микроскопия

Она используется для изучения структуры клеток и тканей на макромолекулярном и субклеточном уровнях. Электронная микроскопия позволила сделать качественный скачок в сфере исследований.

Этот способ широко применяется в биохимии, онкологии, вирусологии, морфологии, иммунологии, генетике и прочих отраслях. Значительное усиление разрешающей способности оборудования обеспечивается потоком электронов, которые проходят в вакууме сквозь электромагнитные поля.

Последние, в свою очередь, создаются специальными линзами. Электроны обладают способностью проходить сквозь структуры объекта либо отражаться от них с отклонениями под разными углами.

В результате создается отображение на люминесцентном экране прибора. При просвечивающей микроскопии получается плоскостное изображение, при сканирующей, соответственно, объемное.

Разрешение микроскопа можно увеличить, используя поток электронов вместо светового потока. Именно этот принцип был реализован в электронном микроскопе, при этом получено разрешение в 1 ангстрем (0,1 нм).

Такое разрешение было достигнуто для кристаллических материалов. Однако для большинства биологических материалов разрешение 1–2 нм обычно считается пределом из-за низкой контрастности объекта.

Поэтому для увеличения контраста биологические объекты обрабатываются солями тяжелых металлов (урана, свинца и др.). В таком случае электронная микроскопия дает в десятки и даже сотни раз большее увеличивающее разрешение по сравнению со световой микроскопией и позволяет подробно изучать ультраструктуру клетки.

В просвечивающих, или трансмиссионных, электронных микроскопах (сокращенно ПЭМ или ТЭМ) изучение объектов проводится на сверхтонких срезах, через которые пучок электронов проходит насквозь.

Существуют также электронные микроскопы, получающие изображение объекта в отраженном пучке электронов, их называют сканирующими электронными микроскопами (сокращенно СЭМ).

Метод сканирующей электронной микроскопии позволяет изучать трехмерную, объемную картину поверхности клетки. При этом методе фиксированный и обезвоженный объект покрывается тонким слоем металла (золота или платины), от зеркальной поверхности которого отражаются электроны.

Необходимые условия

Стоит отметить, что перед тем, как пройти электронное микроскопическое исследование, объект подвергается специальной подготовке. В частности, используется физическая либо химическая фиксация тканей и организмов.

Секционный и биопсийный материал, кроме этого, обезвоживают, внедряют в эпоксидные смолы, разрезают алмазными или стеклянными ножами на ультратонкие срезы.

https://www.youtube.com/watch?v=t9nehPASg7A

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Медицинский взгляд на еду
Adblock
detector