Современные методы цитологических исследований таблица — АНТИ-РАК

Гистологическая техника

Современные методы

исследования

Галилео-Галилей (1564-1642)

(итальянский философ, математик, физик

и астроном, оказавший значительное

влияние на науку своего времени;

изобретатель микроскопа)


Один из первых

микроскопов

(1876)

Микроскоп Левенгука

Микроскоп Гука


Микроскоп

как предмет роскоши

С середины ХХ века цитологи получили возможность исследовать не

только целые клетки, но и отдельные органоиды, выделенные из клеток в

жизнеспособном состоянии.


Для этого используется метод фракционирования клеток, основанный на

дифференциальном центрифугировании.

Центрифуга

Разные органоиды осаждаются на дно

пробирки при разных скоростях

центрифугирования.

Скорость оседания зависит от размера


частицы и ее плотности.

При низких скоростях

центрифугирования в первую очередь

осаждаются ядра. Получив осадок ядер,

оставшуюся суспензию переливают в

другую пробирку для следующего этапа

центрифугирования. Осадок, состоящий


из клеточных ядер, размешивают и

используют в экспериментальной работе.

Так повторяют несколько раз, увеличивая

скорость и продолжительность

центрифугирования. Самые высокие

скорости центрифугирования

необходимы для получения самых

маленьких органелл – рибосом.

Метод фракционирования


С помощью этого метода впервые в

клетках были открыты лизосомы –

небольшие вакуоли, содержащие

гидролитические ферменты и

выполняющие пищеварительные


функции в клетках. После открытия

лизосом методом фракционирования, их

обнаружили на срезах клеток под

световым и электронным микроскопом с

помощью метода цитохимии, выявив

работу специфических ферментов.

Возможность получения чистых фракций

отдельных органоидов позволила изучить их

химический состав, набор ферментов и, в


конечном итоге, понять, как работает та или

иная клеточная структура.

Метод авторадиографии

Метод авторадиографии используют для выяснения, в

каких местах в клетке идет синтез тех или иных полимерных

молекул, для изучения, куда переносятся синтезированные

вещества.

Иначе метод называют радиоавтографией.

Этот метод может использоваться применительно и к


световой, и к электронной микроскопии.

Метод позволяет обнаруживать в клетке биологические

полимерные молекулы, меченые радиоактивными

изотопами.

Ядра радиоактивных изотопов нестабильны, подвергаются

распаду, испуская заряженные частицы или γ-лучи.

Экспериментатор регистрирует этот радиоактивный распад


на фотопленке.

проросток микрокаллус

эмбриоиды

протопласты

Схема (слева) фото (справа) получения регенерантов из протопластов

протопласт→первое клеточное деление→микрокаллус→эмбриогенный


каллус→соматический эмбриоид→проросток→растение

Через каллусную культуру

успешно размножаются

сахарная свекла, злаковые

капустные, подсолнечник и


другие культуры.

Растениерегенерант твердой

пшеницы

Каллус — особая ткань,

состоящая из недифференцированных

клеток

Каллус на

питательной среде

Дифференциация побегов из каллуса


яблоня

Микроклональное размножение –

размножение растений in vitro, «в

пробирке».

Его преимущество перед другими способами

получение генетически однородного посадочного материала;

освобождение растений от вирусов; высокий коэффициент


размножения (от 104 для хвойных до 106 — для травянистых

растений);

сокращение продолжительности селекционного процесса;

ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной

фазе развития;


размножение растений, трудно размножаемых традиционными

способами;

возможность проведения работ в течение всего года;

возможность автоматизации процесса выращивания.

Эксплантами для

культивирования in vitro в

зависимости от задач

исследования могут быть все

части растения: верхушки


побегов, листья, пазушные почки,

стебли, корни

Эрнст Аббе (Ernst Abbe,1840 — 1905)

Разработал дифракционную теорию

микроскопа

Обосновал представления о

дифракционном пределе

разрешения микроскопа

Стефан Хель (Stefan W. Hell, 1962 — )


Разработал метод

управления

разрешением светового микроскопа,

позволяющий преодолеть предел

Аббе

Конфокальная микроскопия

Основное достоинство конфокального микроскопа – не увеличение


разрешающей способности, а существенное увеличение контрастности

изображения.

Конфокальный микроскоп дает две неоценимые возможности: он

позволяет исследовать ткани на клеточном уровне в состоянии

физиологической жизнедеятельности, а так же оценивать результаты

исследований в четырех измерениях: высота, ширина, глубина и время.

В таком микроскопе используются принципы иммуноцитохимии с


применением специальных люминисцентных красителей для конфокальных

микроскопов.

Использование конфокального

микроскопа позволило

локализовать отдельные гены в

структуре интерфазного ядра,

изучать одновременно два или более

белков, помеченных разными

антителами, чтобы понять существует


ли функциональная связь между ними,

исследовать динамические процессы в

клетке, в том числе и транспорт веществ

через мембраны.

Благодаря использованию научнотехнических достижений ХХ и ХХI веков,

в цитологии были разработаны новые

методы, позволившие перейти на новый

молекулярный уровень исследований с


возможностью изучения не только

структур клетки, но и молекул,

выполняющих разнообразные функции.

Детектор

Точечная

диафрагма


Фильтры

Лазер

Объектив

Препарат

Трехмерная реконструкция клеточного ядра,

на которой видно, что каждая хромосома

занимает свою территорию (G.Kreth et al., 2000)

Изучение живых клеток и тканей позволяет получить наиболее полную


информацию об их жизнедеятельности – проследить процессы движения,

деления, разрушения, роста, дифференцировки и взаимодействия клеток,

продолжительность их клеточного цикла, реактивные изменения в ответ на

действие различных факторов.

Методы

Прижизненное

в организме (in vivo)

• Вживление прозрачных камер


• Прижизненная микроскопия

• Трансплантация

Прижизненное в культуре

клеток и тканей (in vitro)

• Суспензионные культуры

• Монослойные культуры


• Культивирование in vivo

назад

оглавление далее

• тонкие (толщина

более 1 мкм)

• полутонкие


(толщина менее

1 мкм)

• ультратонкие

(толщина менее

0,1 мкм)

Мазок


• крови

• красного

костного

мозга

• спинномозговой

жидкости


• слюны

• влагалищный

• и др.

Отпечаток

селезенки

тимуса

печени

слизистой


оболочки

мочевого

пузыря

• слизистой

оболочки

щеки

• и др.

назад


Пленка

• брюшины

• плевры

• мягкой мозговой

оболочки

• соединительной


ткани

• и др.

оглавление далее

оглавление далее

Гистологические препараты, как правило, представляют собой срезы (толщиной

5-15 мкм) органов, тканей или клеток, окрашенные специальными гистологическими

красителями.


сохранять прижизненное состояние структур;

быть достаточно тонким и прозрачным для изучения его под

микроскопом в проходящем свете;

быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под

микроскопом четко определяться;


препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и

использоваться для повторного изучения.

Процесс изготовления гистологического препарата включает включает следующие

1. Взятие и фиксация материала

2. Уплотнение материала

3. Приготовление срезов


4. Окрашивание срезов

5. Заключение срезов в прозрачную среду

основные

основания,

связываясь с

кислотными

соединениями

гистологических

структур, вызывают


обычно их

базофилия

метахромазия

нейтральные

кислые

содержат как

основные, так и


кислые красящие

компоненты

соединяясь с

основными

(щелочными)

соединениями

гистологических

структур,

окрашивают их в


цвета красителя

нейтрофилия

оксифилия

назад

оглавление далее

Просим использовать работы, опубликованные на сайте, исключительно в личных целях. Публикация материалов на других сайтах запрещена.

Данная работа (и все другие) доступна для скачивания совершенно бесплатно. Мысленно можете поблагодарить ее автора и коллектив сайта.

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Подобные документы

История зарождения гистологии как науки. Гистологические препараты и методы их исследования. Характеристика этапов приготовления гистологических препаратов: фиксация, проводка, заливка, резка, окрашивание и заключение срезов. Типология тканей человека.

Основной предмет изучения гистологии. Главные этапы гистологического анализа, объекты его исследования. Процесс изготовления гистологического препарата для световой и электронной микроскопии. Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия, сущность метода.

Методы изучения морфологии микроорганизмов при микроскопии препаратов, приготовленных из чистых культур путем окрашивания. Способы витальной окраски микроорганизмов для избежания артефактов, появляющихся в результате токсического действия красителя.

Гистология — наука о строении, развитии и жизнедеятельности тканей животных организмов и общих закономерностях тканевой организации; понятие цитологии и эмбриологии.

Методы световой микроскопии, темного поля, фазового контраста, наблюдения в инфракрасных и ультрафиолетовых лучах, в свете люминесценции. Поляризационная, электронная микроскопия.

Определение назначения и описание механизма гистохимических методов идентификации химических веществ в гистологических срезах. Описание электронной, люминесцентной и ультрафиолетовой микроскопии. Радиоавтография и культура клеток и тканей вне организма.

Классификация и номенклатура ферментных препаратов, характеристика их активности. Микробиологический и биохимический контроль производства. Регуляция синтеза и технологические схемы производства микробных протеиназ. Экстрагирование ферментных препаратов.

Особенности разработки учениками старших классов социального проекта для благоустройства и эстетического оформления цветников на территории г. Перевоз.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ И ЦИТОЛОГИИ

Ивановская государственная медицинская академия

Кафедра гистологии, эмбриологии и цитологии

Методы исследования в


гистологии, цитологии и

эмбриологии

Часть I

к.м.н., старший преподаватель М.Р. Гринева

д.м.н., профессор С.Ю. Виноградов


д.м.н., профессор С.В. Диндяев

далее

Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов и их изучение с помощью микроскопа.

— Ультрафиолетовая микроскопия – основана на использовании ультрафиолетовой части спектра для просвечивания объекта.

Для изучения тонкого внутреннего строения клеток и межклеточных структур (ультраструктур) используют Электронную микроскопию.

Для выявления в клетках различных химических соединений (аминокислот, белков, жиров, углеводов, минеральных веществ и т. д.) используют Гистохимические методы исследования, основанные на использовании красителей, которые избирательно связываются только с теми химическими соединениями клетки, которые необходимо изучить, и окрашивают их, делая видимыми.

Метод радиоавтографии, основанный на введении в клетку изотопов, которые включаются в соответствующие структуры (например, меченый тимидин встраивается в ядра клеток, синтезирующих ДНК), используется для изучения течения синтетических процессов в тканях.

Для изучения механизмов пролиферации и дифференцировки клеток, их реакции на различные воздействия используют Метод культуры клеток и тканей, который основан на выращивании вне организма в искусственных питательных средах различных клеток.

Одним из современных методов, используемых в гистологии, является Конфокальная микроскопия, которая позволяет получать трёхмерное изображение исследуемого объекта с помощью специальных компьютерных программ.

Существует ещё много методов, используемых для изучения клеток и тканей, с которыми вы можете ознакомиться в учебной литературе (см. список литературы) и на лекциях.

//knowledge. allbest. ru/biology/c-3c0b65625b2bd78a4d53b88421206c26.html

//lektsii. net/1-158357.html

23. Методы микроскопии

1665 г – монография «Микрография»,

где описаны его микроскопические и

телескопические наблюдения


Роберт Гук

(1635-1703)

КЛЕТКА КАК ЧУДО ИНЖЕНЕРИИ ПРИРОДЫ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ШКАЛА РАЗРЕШАЮЩЕЙ

СПОСОБНОСТИ НЕВООРУЖЕННОГО ГЛАЗА, СВЕТОВОГО

И ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПОВ

УСТРОЙСТВО И ПРИНЦИП РАБОТЫ МИКРОСКОПА


1. Механическая часть

1.1. Корпус

1.2. Механический

(предметный) столик

1.3. Бинокулярная насадка


1.4. Фокусировочный

механизм

2. Осветительная система

2.1. Источник света

2.2. Коллектор

2.3. Конденсор

3. Оптическая часть

3.1. Объективы


3.2. Окуляры

Современный световой микроскоп

Осветительная система светового

Ход лучей в стандартном микроскопе

источник

света

образец


окуляр

объектив

глаз

конденсор

Ход лучей в современном микроскопе

коллектор

источник


света

конденсор

образец

окуля

объектив

изображение


образца

РАЗРЕШЕНИЕ МИКРОСКОПА

Разрешение микроскопа по полю – минимальное расстояние между двумя точками

формируемого им изображения, пока они еще видны раздельно.

света,

2 n sin / 2

l – длина волны используемого


n – показатель преломления среды,

– угол раскрытия объектива.

коллектор

источник

света

конденсор


объектив окуля

изображение

образца

образец

d 0,61


NA – численная апертура объектива, равная n sin( /2).

Разрешение микроскопа по глубине – глубина фокуса.

4 n 1 1

МИКРОСКОП КАК ДИФРАКЦИОННЫЙ ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЬ

Дифракция лазерного луча с длиной волны 650 нм,

прошедшего через отверстие диаметром 0,2 мм

F (u )

f ( x )[cos( 2 xu) i sin( 2 xu)]dx


Прямое преобразование Фурье

f ( x)

F (u )[cos( 2 xu) i sin( 2 xu)]du

Обратное преобразование Фурье

Закон масштаба, который гласит, что чем меньше размеры объекта, тем больше

размеры его диффракционной картины

МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ

метод светлого поля в проходящем свете

метод косого поля


метод светлого поля в отраженном свете

2) Метод темного поля

3) Метод фазового контраста

4) Метод поляризационной микроскопии

5) Метод интерференционной микроскопии

6) Метод флуоресцентной микроскопии


7) Метод люминисцентной микроскопии

8) Метод электронной микроскопии

сканирующая электронная микроскопия

Методы современной цитологии

Цитохимия

Методы основанные на

использовании

специфических красителей

(судан черный)


Проведение химической реакции на

срезе на предметном стекле (реакция

Фельгена на выявление ДНК)

С помощью цитохимических цветных реакций в клетках выявляют

полисахариды,

специфические аминокислоты в белках,

нуклеиновые кислоты,


жиры,

липиды

и множество ферментов, участвующих в метаболических

процессах обмена и превращения веществ.

Ферменты обычно выявляют по наличию продуктов их активности.

Новое направление цитохимии –

иммуноцитохимия,

в настоящее время является


одним из самых передовых

методов клеточной биологии.

Для этого метода используются

люминисцентные микроскопы.

Разрешение таких микроскопов


соответствует световым.

Их особенность в том, что

препарат освещается снизу не

пучком видимого света, а

ультрафиолетовым лучом

определенной длины волны.

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИИ

Устройство


флуоресцентного микроскопа

Упрощенная схема хода

лучей во флуоресцентном

микроскопе

Возможности технологии флуоресцентной микроскопии и не только


Иммуноцитохимия

Другая особенность метода в том, что

используются не обычные,

а люминисцентные, или флюоресцентные

красители для окрашивания препаратов.

Такие красители под воздействием

ультрафиолета дают яркое свечение.

Исследователь видит препарат на темном фоне,

где ярко светятся окрашенные участки клеток.


Культура стромальных стволовых клеток человека.

Зеленым флюоресцирует цитоплазма, содержащая

нестин, синим — ядерный материал.

красным цветом флуоресцирует ДНК клеток, зеленым – клеточная

стенка и цитоплазма с содержащимися в ней пластидами.

С помощью метода иммуноцитохимии изучили

состав и расположение элементов цитоскелета клеток

растений и животных,

какие особенности цитоскелета характерны для опухолевых


клеток.

С помощью этого метода научились выявлять

индивидуальность хромосом человека,

что необходимо при изучении развития патологий, а так же в

судебной медицине.

Метод иммуноцитохимии

позволил выявить на поверхности

разнообразных клеток свои

индивидуальные маркеры, что


облегчило понимание многих

патологических процессов,

позволило выяснить, какие

клеточные типы являются

отправной точкой в развитии ряда

болезней.

Например, показана роль

макрофагов и гладкомышечных

клеток кровеносных сосудов в


развитии атеросклероза.

Электронная микроскопия дает в100 раз большее разрешение

биологических объектов по сравнению со световой

микроскопией.

В электронном микроскопе изображение строится с помощью

узкого пучка электронов, с высокой скоростью проходящего

через срез ткани и взаимодействующего с ним.

Помимо трансмиссионной электронной микроскопии существует

растровая (сканирующая) электронная микроскопия, когда изображение


строится с помощью электронного луча, отраженного с поверхности

изучаемого объекта. Такие электронные микроскопы называются

сканирующими.

В микроскопе образец сканируется узким пучком электронов.

Когда луч электронов попадает на образец, то поверхность образца, на


которую нанесен тонкий слой золота, испускает «вторичные электроны».

Они регистрируются прибором и преобразуются в изображение на

телевизионном экране. Максимальное разрешение сканирующего

микроскопа меньше, чем трансмиссионного, и составляет 10 нм для

биологических объектов, а увеличение Х20 000.

С помощью сканирующих микроскопов изучают внутренние поверхности

кровеносных сосудов, поверхности клеток и небольших структур.

Сканирующий микроскоп дает объемное изображение.

оглавление далее

Оптическая

Световая

Поляризационная

Темнопольная

Фазовоконтрастная


Электронная

Просвечивающая

(трансмиссионная)

Сканирующая

(растровая)

Флюоресцентная

(люминесцентная)

Изучение гистологического препарата осуществляется в проходящем свете

с помощью светового микроскопа.

Источник света естественный или искусственный (различные лампы). Свет

собирается в конденсор и далее направляется через препарат в объектив.

Окуляр дополнительно увеличивает это изображение.

Качество

изображения


(четкость)

определяется

разрешающей

способностью микроскопа, т.е. минимальным (разрешающим) расстоянием,

на котором оптика микроскопа позволяет различить раздельно две близко

расположенные точки. Эта величина пропорциональна длине световой волны и

для обычного светового микроскопа равна приблизительно 0,2 мкм.

Чем меньше разрешающее расстояние, тем выше разрешающая способность


микроскопа и тем более мелкие объекты можно исследовать.

Увеличение микроскопа – это соотношение между истинными размерами

исследуемого объекта и размерами его изображения, получаемого с помощью

микроскопа. Ориентировочно оно оценивается как произведение увеличений

объектива и окуляра и может достигать 2500 раз.


Основание микроскопа

Тубусодержатель

Тубус

Окуляр (чаще ×7)

Револьвер микроскопа


Объективы

а) сухие: ×8, ×20, ×40

б) иммерсионный ×90

7. Предметный столик

8. Конденсор


9. Макрометрический винт

10.Микрометрический винт

11.Винт конденсора

12.Зеркало

Общее увеличение микроскопа = увеличение объектива × увеличение окуляра

назад


оглавление далее

1. Микроскопирование гистологического препарата начинают с установки правильного

освещения. Для этого с помощью вогнутого зеркала, собирающего рассеянный пучок

света, и конденсора достигают равномерного освещения поля зрения.

2. На предметный столик помещают гистологический препарат покровным стеклом вверх.


3. Изучение гистологического препарата начинают при малом увеличении (объектив х8), при

этом расстояние между объективом и покровным стеклом должно быть около 1 см.

Установку резкости проводят с помощью макровинта.

4. Рассматривают детали гистологического препарата по всей площади, перемещая его на

предметном столике.

5. Устанавливают в центр поля зрения участок гистологического препарата, который следует

изучить при большом увеличении (объектив х40).


6. С помощью револьверного устройства ставят объектив с более сильным увеличением

(х40). Установку резкости проводят с помощью микровинта.

7. Для изучения очень мелких гистологических структур используют иммерсионный

объектив (х90).

• На покровное стекло препарата наносят каплю иммерсионного масла.

• Осторожно опускают тубус до соприкосновения линзы объектива к маслу.

Установку резкости проводят с помощью микровинта.

• После окончания работы иммерсионное масло удаляют с объектива и покровного

стекла марлей.

Почка.

Окраска: гематоксилин-эозин.

Увеличение: х 56

(малое увеличение).

Почка.

Увеличение: х 280


(большое увеличение).

Почка.

Увеличение: х 630

назад

(иммерсионное

увеличение).


оглавление далее

Основана на использовании специального конденсора, освещающего

препарат «косыми» лучами, не попадающими в объектив.

При наличии объекта в поле зрения свет отражается от него и

направляется в объектив.


Метод часто используется для изучения живых неокрашенных клеток.

назад

оглавление далее

Позволяет обнаружить двойное лучепреломление – анизотропию.

На объект исследования направляется поляризованный пучок света, т.е. лучи света

направлены строго в одной плоскости.

Это обеспечивает особый фильтр – поляризатор. Такой свет направляется на объект


исследования.

Второй фильтр – анализатор расположен между объективом и окуляром и позволяет

регистрировать угол отклонения плоскости поляризации света.

Микроскопия позволяет регистрировать пространственное расположение молекул в

объективе или кристаллические структуры.

Кристаллы оксалатов.

Поляризационная

микроскопия.


Увеличение х100

Метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных объектов, в

частности, позволяет изучать живые неокрашенные препараты.

Даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата

световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает

2. Оглавление

Введение

Методы исследования живых клеток и тканей

Виды гистологических препаратов фиксированных клеток

Изготовление гистологического препарата


Гистологический препарат

Взятие материала

Фиксация материала

Уплотнение материала

Приготовление срезов

Виды микротомов

Окрашивание срезов


Методы окрашивания

Типы красителей

Заключение срезов в консервирующую среду

Методы микроскопии

Световая микроскопия

Устройство светового микроскопа

Техника микроскопирования

Темнопольная микроскопия


Поляризационная микроскопия

Фазово-контрастная микроскопия

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия

Электронная микроскопия

Рекомендуемая литература


назад

далее

3. Введение

В современной гистологии, цитологии и эмбриологии применяются

разнообразные методы исследования, позволяющие всесторонне изучать

процессы развития, строения и функции клеток, тканей и органов.

Главными этапами цитологического и гистологического анализа являются

выбор объекта исследования

подготовка его к микроскопированию


применение методов микроскопирования

качественный и количественный анализ изображения

Объектами

исследования

служат

гистологические

изготовленные из живых или фиксированных клеток.


препараты,

оглавление далее

9. Фиксация материала

Изготовление гистологического препарата производится из органов и тканей,

биопсия (пунктат),

операционным путем,

секционный (трупный) материал,

экспериментальный


1. Забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти

или забоя экспериментального животного, а при возможности от живого

объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или

органа.

2. Забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не


травмировать ткани.

3. Толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий

раствор мог проникнуть в толщу кусочка.

4. Обязательно

производится

маркировка

кусочка


(указывается

наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата

забора и так далее).

Цель фиксации материала – сохранение прижизненного морфологию

клеток и тканей, предотвращение аутолиза и посмертных изменений.


Фиксатор вызывает денатурацию белка и стабилизацию липидов и тем

самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их

прижизненном состоянии.

Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие

жидкости, которые могут быть простыми (формалин, спирты, глутаровый

альдегид, ацетон) и сложными (раствор Карнуа, фиксатор Ценкера и др.).

Фиксация может достигаться также замораживанием (охлаждением в струе


СО2, жидким азотом и др.).

Подбор фиксаторов и продолжительность фиксации индивидуален для

различных органов и тканей и обычно колеблется от 2 до 24 часов.

Целью этого этапа является придание исследуемому материалу такой

плотности, которая позволит получить тонкие срезы необходимой толщины.

Замораживание образца с последующей резкой на замораживающем

микротоме.


Пропитывание уплотняющими средами (парафин, эпоксидные смолы и др.)

Промывка материала проточной водопроводной водой для удаления

фиксатора.

Обезвоживание (дегидратация) материала в спиртах увеличива-ющейся

концентрации (70, 80, 90, 96, абсолютный – 100%).

Удаление спирта и подготовка материала к пропитыванию парафином

обработкой растворителями парафина (ксилол и др.) и смесью парафина и

ксилола (при температуре 37°С)


Заливка в чистый расплавленный парафин (при температуре 56°С).

Охлаждение парафина и формирование блоков.

14. Методы окрашивания

Для изготовления тонких срезов заданной толщины в настоящее время

используются специальные приборы – микротомы (для световой микроскопии)

и ультрамикротомы (для электронной микроскопии).

3-8 мкм из материала, залитого в парафин,

10-25 мкм из материала, замороженного в камере микротома-криостата

0,08-0,1 мкм из материала, подготовленного для электронной микроскопии


Полученные срезы помещают на предметные стекла (для световой

микроскопии) или монтируются на специальные сеточки (для электронной

микроскопии).

Клеточные

структуры


специальной

обработки,

правило,

различимы даже при большом увеличении микроскопа. Они бесцветны и

прозрачны.


Для выявления тканевых компонентов, отдельных клеток, внутриклеточных

структур используют красители – вещества с высоким сродством к различным

компонентам ткани и с определенными цветооптическими свойствами.

Способность тканевых компонентов по-разному окрашиваться зависит от

кислотно-основных (щелочных) свойств веществ, входящих в их состав.

Перед окрашиванием срезы депарафинируют, проводя последовательно


через растворитель парафина (ксилол), спирты нисходящей концентрации (100,

96, 90, 80, 70%) и помещают в воду.

Общегистологические

Специальные

Гистохимические

выявление

общего плана


строения

клеток, тканей,

органов

выявление

специализированных

структур в


клетках и

тканях

анализ

химического

состава клеток


межклеточного

вещества

назад

Импрегнация

выявление


специализированных

структур в

клетках и

тканях

оглавление

далее

Окрашенные гистологические препараты обезвоживаются в спиртах


восходящей концентрации (70, 80, 90, 96, абсолютный – 100%) и

просветвляются в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах.

Для длительного хранения обезвоженный гистологический срез заключают

(монтируют) в прозрачную консервирующую среду (смолу хвойных деревьев –

канадский, пихтовый бальзам, а также в синтетические среды).

На постоянном гистологическом препарате срез ткани располагается на


предметном стекле, сверху закрыт покровным стеклом. Между стеклами

(предметным и покровным) находится заливочная среда, обладающая

коэффициентом преломления световых лучей, близким к таковому у стекла.

12. Виды микротомов

санный

ротационный

криостатный

замораживающий


гистохимии

вибротом

изготовление

парафиновых

срезов

изготовление


серийных

парафиновых

срезов

изготовление

срезов при

температуре

-20°С и ниже


для гистохимии

и иммуноцитохимии

изготовление

32. Метод авторадиографии

Авторадиограмма,

показывающая распределение

фосфора в листьях томата

Включение в ядра

соединительнотканных клеток


меченного тритием тимина

(Н3-Т)

Именно методом авторадиографии было показано,

ДНК всегда находится в ядре и никуда оттуда не

выходит.

РНК, напротив, синтезируется в ядре, а затем

выходит в цитоплазму.


Белок никогда не синтезируется в ядре.

Место синтеза белка – рибосомы цитоплазмы.

Отсюда белок может перемещаться и в ядро, и

внутрь органелл цитоплазмы.

Метод клеточных культур

Для получения клеточной культуры небольшие кусочки ткани

диссоциируют на отдельные клетки, используя ферментативную и

механическую обработку, и получают суспензию клеток.

стеклянные или пластиковые, и заливают искусственной питательной


средой.

Для каждого типа клеток среда индивидуальна.

Для большинства животных клеток питательная среда имеет в своем

составе глюкозу, незаменимые аминокислоты, витамины и небольшой

процент сыворотки крови.

Важно поддерживать нейтральную реакцию среды, оптимальную

температуру, не допускать инфекционного заражения.

Именно с помощью метода клеточных культур впервые были описаны особенности опухолевых

клеток.


Первая особенность – способность к бесконечному делению.

В 50-ые годы ХХ века была получена перевиваемая клеточная культура раковых клеток опухоли

молочной железы.

Культура получила название HeLa по инициалам оперированной пациентки. Эти клетки живы до

сих пор, и с ними работают во многих лабораториях мира. За прошедшие годы ученые вырастили

тонны этих клеток, хотя самой пациентки давно уже нет.

Другая особенность раковых клеток – отсутствие контактного торможения. Они не прекращают


делиться, заполняя всю поверхность сосуда. Клетки наползают друг на друга, могут образовывать

второй и третий слой.

Ослабленным контактным торможением характеризуются

раковые клетки

Раковые клетки продолжают расти и

после того, как заполнят всю поверхность

субстрата, образуя мультислой.


Нетрансформированные

нормальные

клетки могут

делиться

ограниченное

количество раз.


Микрофотография

(сканирующий электронный

эпидермальная карцинома

человека. Стрелками показаны

места «наползания» клеток друг

на друга

Клеточная терапия болезней

миокарда


1. Оплодотворенная яйцеклетка (зигота)

2. Зигота делится надвое

3—4. Митотическое деление

продолжается

5. Через 5 дней образуется бластоциста

— шарик из клеток, наружный слой

которого должен дать начало плаценте,


а внутренний — всем тканям нового

организма

6. Внутреннюю часть бластоцисты

помещают на питательную среду

7. Используя разные химические

сигналы, стволовые клетки превращают


в клетки разных тканей: мышечные,

эпителиальные, костного мозга и другие

8. Клетки — предшественники миоцитов

(клеток сердечной мышцы) впрыскивают

вблизи очага поражения, чтобы они

устранили дефект

15. Импрегнация

Метод выявления тканевых структур путем пропитывания объектов

гистологического исследования растворами солей тяжелых и драгоценных


металлов (например, азотнокислое серебро (серебрение), кобальт, хлористое

золото (золочение), кадмий, осмиевым ангидрид и др. ).

Участки ткани, в которых происходит осаждение солей металлов на

гистологических структурах, приобретают черный или бурый цвет в

зависимости от количества и свойств восстановленного металла.

Периферический нерв

(поперечный срез).

Импрегнация оксидом

осмия


Мультиполярный нейрон.

Импрегнация нитратом серебра

Мультиполярные нейроны.

16. Типы общегистологических красителей

основные

основания,

связываясь с

кислотными


соединениями

гистологических

структур, вызывают

обычно их

базофилия

метахромазия

нейтральные


кислые

содержат как

основные, так и

кислые красящие

компоненты

соединяясь с


основными

(щелочными)

соединениями

гистологических

структур,

окрашивают их в


цвета красителя

нейтрофилия

оксифилия

назад

оглавление далее

17. Базофилия

Основные (щелочные) красители активно связываются со структурами, которые

содержат кислоты и несут отрицательный заряд – например, ДНК, РНК.


К ним, в частности, относятся гематоксилин, толуидиновый синий, тионин,

метиленовый синий, азуры и др.

Способность окрашиваться основными (щелочными) красителями называется

базофилией (от греч. basis – основа и philia – любовь).

Поэтому структуры, связывающие эти красители, называются базофильными.

В клетке базофилией обладает ядро (вследствие высокого содержания ДНК и РНК),


иногда цитоплазма (при высоком содержании в ней рибосом или гранулярной ЭПС).

Базофильно может окрашиваться межклеточное вещество некоторых тканей – например,

хрящевой.

Базофилия ядра

нейтрофильного гранулоцита.

Увеличение: х630.

назад


оглавление далее

19. Оксифилия

Кислые красители связываются со структурами, имеющими положительный заряд –

например, белки.

К таким красителям относятся эозин, оранж G, эритрозин, пикриновая кислота и др.

Способность окрашиваться кислыми красителями называется оксифилией, или

ацидофилией (от греч. oxys или лат. acidus – кислый и греч. philia – любовь).

Структуры, связывающие

ацидофильными.

красители,


называются

оксифильными

Оксифилия свойственна цитоплазме клеток (особенно при высоком содержании в

ней митохондрий и некоторых белковых секреторных гранул), эритроцитам (благодаря

высокой концентрации в них гемоглобина). Оксифильно окрашивается цитоплазма

кардиомиоцитов, мышечных волокон скелетной мускулатуры, некоторые компоненты

межклеточного вещества (например, коллагеновые волокна).

Оксифилия зернистости

эозинофильного гранулоцита.


Увеличение: х630.

назад

оглавление далее

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Медицинский взгляд на еду
Adblock
detector