Окраска по Романовскому — Гимзе

Окраска по методу Муромцева

Чаще применяется
для обнаружения телец-включений
Бабеша-Негри

при бешенстве.

Мазки фиксируют
в метиловом спирте 3-5 минут, теплой
смесью спирта с эфиром напополам.
Фиксирующие жидкости не оказывают
негативного действия на качество
окрашивания в течение 2-3 недель, поэтому
их сохраняют в фиксирующей жидкости.

После фиксации
мазок ополаскивают в дистиллированной
воде и погружают на 10 минут в синьку
Мансона (100 мл дистиллированной воды
добавляют 5-8г буры, 2 грамма кристаллической
метиленовой сини, которую разбавляют
дистиллированной водой 1:40).

Непромытый
мазок выдерживают в 10% растворе танина
до перехода цвета мазка из сине-фиолетового
в светло-голубой. Затем мазок промывают
водой, высушивают фильтровальной
бумагой.

Мазок микроскопируют в
иммерсионной системе без покровного
стекла. Цитоплазма нервных клеток
светло-голубого цвета, ядра клеток
синие, тельца Бабеша-Негри розово-фиолетовые
или красные с темными включениями.

при бешенстве.

Окраска по методу Михина

Мазки фиксируют
в фиксирующей жидкости, высушивают

фильтровальной
бумагой и окрашивают 30-40 минут краской
Романовского, разведенной 1:10. Затем
мазки промывают подкисленным спиртом
(1 капля ледяной уксусной кислоты на 30
мл 960 спирта),
а затем водой.

Мазки высушивают
фильтровальной бумагой и микроскопируют.
Фон мазка должен быть фиолетово- розовый,
нервные клетки голубого цвета, ядра
клеток темно-фиолетовые, а тельца
Бабеша-Негри розово-красные с точечными
включениями темно-синего цвета.

Приготовление красителя

Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 — 25 минут при 37 °C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне).

Красящую смесь Романовского-Гимзы, которая имеет в основе краску Романовского-Райта, в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя).

Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации.

Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя.

Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.

Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды.

Мазки окрашивают 20 — 25 минут при 37 °C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.

Окраска по Романовскому — Гимзе

Красящую смесь Романовского-Гимзы, которая имеет в основе краску Романовского Райта, в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя).

Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации.

Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя.

Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.

Занятие 7 Отбор вирусосодержащего материала от погибших эмбрионов кур и дальнейшая работа с вирусосодержащим материалом.

  1. Студенты
    просматривают
    готовые препараты из патматериала с
    тельцами Бабеша-Негри, Пашена, Руборта,
    окрашенные
    по методу Муромцева и Морозова.

  2. Студенты
    готовят мазки из патматериала, окрашивают
    их по методу Романовского и микроскопируют.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:
Ознакомить
студентов с особенностями отбора

вирусосодержащего
материала от погибших эмбрионов кур и
дальнейшая работа с вирусосодержащим
материалом.


Подготовленный
для работы бокс;

— халаты,
перчатки, маски, головные уборы и бахилы;


зараженные 7-9 суточные куриные эмбрионы;


набор
стерильных хирургических инструментов
— пинцет, ножницы, скальпель
в стаканчике со спиртом;


стерильные пастеровские пипетки с
резиновой грушей;


спиртовки;


иодированный спирт для дезинфекции
скорлупы;



стерильная чашка Петри — 3 шт.;


флакон со стерильным физраствором;


стерильные пробирки — 10 шт.;


штатив для пробирок;


ватный квачик в пустой пробирке для
обжигания скорлупы.

Зараженные
куриные эмбрионы помещают в термостат
для дальнейшей инкубации при температуре
37°С — 38°С в процессе которой происходят
репродукция внесенных вирусов и их
накопление в соответствующих структурах.

За
эмбрионами ведут постоянное наблюдение,
просматривают на овоскопе, отбирая
погибших. Погибшие эмбрионы не обладают
подвижностью, их кровеносные сосуды
загустевают или в них выражена
прерывистость, нет пульсации.

Гибель
эмбрионов в первые 24 ч после заражения
чаще всего обусловлена размножением
грибов, бактериальной микрофлоры,
внесенных в эмбрион вместе с инокулятом,
или травмированием при заражении.

Эта
гибель считается неспецифической. В
более поздние сроки эмбрионы гибнут в
результате, как правило, размножения в
эмбрионах вируса. Обнаружив погибшие
эмбрионы, их сразу же переносят в
холодильник с температурой 4°С.

Такие
условия, с одной стороны, способствуют
сохранению активности накопившегося
в эмбрионе вируса, с другой – уплотнению
тканей и запустению сосудов, что
значительно облегчает последующее
вскрытие.

ПОДРОБНЕЕ:   Зонд урогенитальный тип G ЦЕРВЕКС-БРАШ

Эмбрионы инкубируют до момента
максимального накопления вируса. Для
каждого вируса и даже штамма этот срок
является определенным и варьирует в
пределах от 2 до 7-8 суток.

Вскрывают
куриные эмбрионы с целью обнаружения
признаков размножения в них вирусов и
получения вирусосодержащего материала.
Последнее требует правил асептики при
вскрытии.

В
зависимости от того, каким вирусом был
заражен эмбрион (а значит в какой
структуре он накопился соответственно
тропизму), вирусосодержащим материалом
могут служить ХАО, ткани зародыша,
желточный мешок (его стенки), а также
аллантоисная и амниотическая жидкости.

В последнем случае выделение вируса
наиболее удобно, так как экстраэмбриональные
(аллантоисная, амниотическая) жидкости
представляют, по существу готовую
суспензию вируса.

Перед
вскрытием скорлупу обрабатывают
йодированным спиртом (фламбируют).
Стерильным ножницам срезают скорлупу
над воздушной камерой, через которую
заражали.

Обнажившуюся
ХАО осматривают, приподнимая ее пинцетом
с целью установления в ней
патологоанатомических изменений. Часть
ХАО, на которую был нанесен вирусосодержащий
материал, имеет обычно наиболее выраженные
изменения.

Для более тщательного осмотра
ее и взятия этой части приподнимают
пинцетом ХАО в этом месте срезают как
можно больше, переносят ее в стерильную
чашку Петри с физраствором, ополаскивают,
расправляют пинцетами и рассматривают
на темном фоне.

Наиболее характерные
изменения на ХАО соответствуют
определенному вирусу: очень часто
просматриваются округлые воспалительные
очаги, белесоватые перламутровые бляшки
с некротическим центром, серовато-белый
цвет оспин, расширение сосудов и др.

Аллантоисную
жидкость в количестве до 10 мл отсасывают
пипеткой, которой прокалывают
подскорлуповую оболочку ХАО над телом
зародыша. Такое направление пипетки
предотвращает случайный разрыв стенки
желточного мешка и смешивание его
содержимого с набираемой аллантоисной
жидкостью.

Амниотической
жидкости удается отсосать до 1 мл. Для
этого после удаления аллантоисной
жидкости пипетку вводят в амнион между
головой и телом зародыша под его шеей.

Для
получения желточного мешка как
вирусосдержащего материала желток
извлекают на чашку Петри, стенку его
разрезают ножницами и отполаскивают
от содержимого в физрастворе. Тело
зародыша извлекают удерживая его за
шею.

Наличие
гемагглютинирующего вируса определяют
в ориентировочной реакции гемагглютинации.

При
вскрытии куриных эмбрионов ставят
бактериологический контроль
вирусосодержащего материала посевом
на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро.
Вирусосодержащий материал хранят при
минус 25°С и ниже.

  1. 1.Студенты
    знакомятся с оборудованием бокса.

  2. Студенты
    знакомятся с методами заражения культур
    клеток вирусом.

  3. Студенты
    проводят микроскопию погибших зараженных
    культур клеток.

  4. Студенты
    знакомятся с методами заражения культур
    клеток вирусом.

  5. Студенты
    проводят микроскопию нормального
    монослоя культур клеток.

  6. Студенты
    оценивают ЦПД монослоя культур клеток
    под действием вируса.

  1. Студенты
    знакомятся с особенностями устройства
    вирусологических лабораторий.

  2. Студенты
    знакомятся с правилами техники
    безопасности при работе с вирусами и
    вируссодержащим материалом.

  3. Студенты
    знакомятся со схемой диагностики
    вирусных болезней.

Подбор культур клеток.

ЦЕЛЬ
ЗАНЯТИЯ: показать
студентам сканирующий микроскоп,
рассказать о его устройстве и работе с
ним.


Сканирующий
микроскоп фирмы «Тесла» (Чехия);


фотографии объектов, сделанные на
электронном микроскопе;


микротом;


оборудование для приготовления
препаратов.

Область применения
оптического светового микроскопа

ограничивается
его разрешающей способностью (минимальная
величина наблюдаемого объекта или
способность различать наименьшее
расстояние между двумя точками).

Самые малые
предметы, различаемые человеческим
глазом, имеют размер около 0,2мм, а с
помощью светового микроскопа можно
различать объекты величиной около
0,2мкм.

Максимально возможное увеличение
оптического микроскопа составляет от
1000 до 20000 раз. Но этого увеличения
недостаточно для исследования очень
тонких структур и более мелких частиц
(вирусы, дымы и т. д.).

Применение же
световой микроскопии еще больших
увеличений оказывается бесполезным,
так как при этом более мелкие детали
рассматриваемых объектов не видны.

При
этом изменяется масштаб изображения,
а разрешающая способность остается той
же, так как разрешающая способность
ограничивается волновой природой света,
что и у оптических систем с увеличением
в 2000 раз.

Поэтому при
самых оптимальных условиях лучшие
световые микроскопы вследствие явления
дифракции позволяет наблюдать частицы
размером около 0,2 мкм.

Изучение
более меньших объектов (меньше 0,2 мкм)
стало возможным лишь при использовании
микроскопии электронных лучей, обладающих
длинами волн во много раз более короткими,
чем световые лучи. Длина волны электронного
луча измеряется ангстремами.

Один ангстрем-
А — равен 1:10 000 000мм. Длина волны видимого
света составляет 4 000- 8 000 А.

Современные
электронные микроскопы имеют полезное
увеличение от 20 000 до 40 000, максимальное
увеличение 200 000.

Использование
микроскопии электронных лучей, т. е.
пучков электронов, движущихся в вакууме
с постоянной скоростью, открыло новые
возможности для исследователей.

ПОДРОБНЕЕ:   Пункция молочной железы под контролем узи с цитологическим исследованием

В современных
электронных микроскопах длина волны
электронного пучка почти в 10 000 раз
короче, чем длина волны видимого света,
что дает возможности наблюдать и изучать
объекты приблизительно в 200 раз более
мелкие, чем в световом микроскопе, т.е.
в 100 раз повышается разрешающая способность
электронного микроскопа.

Одним из
факторов высокой разрешающей способности
электронных микроскопов является его
ускоряющее напряжение, равное 50 000 вольт
и более. Для электронов, ускоренных
напряжением в 50 000 вольт, длина волны
равна 0,05 А.

Оптическая
система электронного микроскопа похожа
на схему светового микроскопа, но в
электронном микроскопе все оптические
элементы светового микроскопа заменены
электрическими, источник света заменяется
потоком электронов, стеклянные линзы
— линзами электромагнитными.

Электронная
микроскопия является одним из наиболее
молодых методов научного исследования,
позволяющих значительно углубить и
расширить знания о строении микромира.

Электронный
микроскоп прочно вошел в практику
физических, химических и биологических
исследований. Он дает возможность
рассматривать крупные молекулы, вирусы,
исследовать структуру твердых тел в
процессе нагревания и охлаждения, сжатия
и растяжения.

Применение
электронной микроскопии позволяет в
ряде случаев сознательно управлять
технологическим процессом, улучшать
качество продукции, устранить или
уменьшить брак.

Современный
электронный микроскоп является не
только прибором для получения больших
увеличений, но и микроэлектрографом, а
при наличии рентгеноспектральных
приставок и микроанализатором химического
состава.

В зависимости
от способов исследования объектов
имеются электронные микроскопы различных
типов:

  1. Просвечивающиеся
    – трансмиссивные.

  2. Сканирующие
    – растровые.

  3. Отражательные
    и другие.

Как было
сказано, основными критериями для оценки
любого микроскопа, в том числе электронного,
является его разрешающая способность,
т. е. способность выявить минимальную
величину наблюдаемого объекта.

1 класс
– имеет разрешающую способность 2 – 10
А

2 класс
– 20 – 30 А

3 класс
– 30 – 50 А

В настоящее
время разработаны и выпускаются
микроскопы с паспортным разрешением
расстояние 2 – 5 А и ниже – 1,43 А.

В различных
странах мира выпускается около 30 разных
типов электронных просвечивающих
микроскопов.

Приборы
первого класса с высоким гарантированным
(10 А и ниже) разрешением и наибольшим
ускоряющим напряжением (10 кв и выше)
выпускают в России, Великобритании,
Японии, Германии и других странах.

У электронных
микроскопов есть один крупный недостаток
– в нем можно видеть лишь мертвые клетки.
Это связано тем, что молекулы воздуха
препятствуют движению электронов,
поэтому вакуум в колоне микроскопа
приводит к немедленному обезвоживанию
и гибели всех живых клеток.

Монопольной
обладательницей электронного микроскопа
с ускоряющим напряжением в 1,5млн вольт
является Франция. В этом микроскопе
скорость электронов близка к скорости
света и равна 291000км в секунду.

окраска цитологических мазков по романовскому

В таком
микроскопе электронные линзы весят
700кг, из которых 100 кг приходится на 29000
витков медной спирали. Микроскоп помещен
в металлический шар диаметром 24 метра.

В таком микроскопе ускоренные в своем
движении электроны проникают не только
через тончайший слой воздуха, но и через
живые клетки. Продолжительное действие
электронов наносит им повреждения, а
потом убивает их, тем не менее при
наблюдении под микроскопом клетки
какое-то время остаются живыми и
неизменными.

Отечественной
промышленностью создан прибор ЭМ-200, с
помощью которого можно рассмотреть
частицу величиной в 1: 2000000 часть миллиметра
— 5 А, увеличив ее через бинокулярное
устройство в 1200000 раз. Выпускаются
электронные микроскопы с разрешающей
способностью 1,5 А.

1 – должны быть
сухими, так как пары воды могут привести
к порче объекта;

3 – препараты не
должны быть сухими;

4 – препараты
должны быть контрастными;

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:
Ознакомить
студентов с лабораторными

животными
и особенностями
культивирования
вирусов в организме лабораторных
животных, с
особенностями
культивирование
вирусов в эмбрионах кур, схемой эмбрионов
кур и методами заражения эмбрионов
кур.


Белые
мыши;

— морские
свинки;


кроли­ки;


клетки для животных;

— бокс;


стерильный
физиологический раствор NaCl;


стерильные пипетки;


иодированный спирт с квачиком;



вата;


эксикатор;


эфир;


подготовленный
для работы бокс;


7-9 суточные куриные эмбрионы;



набор
стерильных хирургических инструментов
— пинцет, ножницы, скальпель в стаканчике
со спиртом;


одноразовые шприцы на 1 мл;


пипетки с парафином;


вируссодержащий материал в пробирке;


спиртовки;


иодированный спирт для дезинфекции
скорлупы;



ватный квачик в пустой пробирке для
обжигания скорлупы.

Всвязи
с тем, что вирусы могут размножаться
только в живых клетках, на самых ранних
этапах развития вирусологии широко
применяли культивирование вирусов в
организме лаборатор­ных животных,
специально выращиваемых для проведения
на них исследований.

ПОДРОБНЕЕ:   Цитологический атлас шабалова касоян

В
вирусологии для постановки биопробы
используют сле­дующие виды лабораторных
животных: белые мыши, белые крысы, морские
свинки, хомячки, кролики, кошки, собаки,
птицы, обезьяны и др.

1. Быть
абсолютно здоровы, т. е. свободными от
инфекции и инвазии.

2.
Обладать стандартной чувствительно­стью
(восприимчивостью) к определенным
вирусам; лучше использовать животных
одной линии.


3.
Должны быть одинакового возраста
(желательно молодые) и пола, породности,
упитан­ности и массы тела.

Плохая
упитанность животных, взъерошенный
волосяной покров, катаральные явления
(насморк, затрудненное дыха­ние), отказ
от корма, понос и другие признаки дают
основа­ние предполагать о заболевании
животного.

В
виварии лабораторных животных содержат
в изолиро­ванных помещениях: 1) для
чистых, т. е. здоровых; 2) для зараженных,
т. е. больных. Кормление лабораторных
живот­ных должно быть строго по
соответствующему рациону, со­держание
— соответствовать зоогигиеническим
нормам.

  1. обнаружения
    вируса в патматериале;

  2. первичного
    выделения вируса из патматериала;

  3. накопления
    вирусной массы;

  4. поддержания
    вируса в лаборатории в активном
    состоянии;

титрования
вируса;

  1. получения
    гипериммунных сывороток;

  2. в
    качестве тест-объекта в реакции
    нейтрализации.

Перед
заражением всех животных маркируют
различны­ми методами: 1) кроликам
выстригают шерсть на спине и боку, на
ушах делают насечки и дырочки, закрепляют
бирки;

2) морских свинок различают по
пятнам и окраске, выстрига­ют шерсть
на спине; 3) птицам навешивают бирки на
крылья, надевают кольца с номером на
ноги;

Методика окраски

  • Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски 2 мл основного буферного раствора 47 мл дистиллированной воды) в течение 40—120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга — 5,8 — 6,0, для мазка крови — 6,4 — 6,5, для выявления простейших — 6,8, малярийного плазмодия — 7,0 — 7,2.
  • Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии.

Результат окраски

Амастиготы Leishmania tropica, расположенные в макрофагах. Увеличение 10×100, окраска по Гимзе.

Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток — в голубой, ядра — в красный. При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра — красно-фиолетовый.

Результаты окрашивания мазков крови

  • цитоплазма лимфоцитов окрашивается в сине-голубой цвет, их ядра — в цвета от интенсивно пурпурного до фиолетового;
  • цитоплазма моноцитов окрашивается в мутный голубовато-серый цвет, их ядра — в более светлый пурпурно-красный, нежная азурофильная зернистость;
  • гранулы базофилов окрашиваются в интенсивный сине-фиолетовый цвет;
  • гранулы эозинофилов окрашиваются в оранжево-розовый цвет;
  • гранулы нейтрофилов окрашиваются в цвета от пурпурного до фиолетового;
  • ядра лейкоцитов фиолетово-красного цвета с хорошо видимой структурой хроматина; хорошо выделяются ядрышки;
  • грануломеры тромбоцитов окрашиваются в красный, гиаломеры — в голубой;
  • розовая окраска гемоглобина.

Занятие 6 Культивирование вирусов в организме лабораторных животных. Культивирование вирусов в эмбрионах кур. Схема эмбрионов кур. Освоение методов заражения эмбрионов кур.


а) приготовление
подложек;

б) приготовление
взвесей, очистка, концентрация объектов
и нанесение их на подложку;

в) высушивание
объектов;

г) контрастирование
объектов.


Белые
мыши;


кроли­ки;

— бокс;


вата;



эксикатор;


эфир;


спиртовки;

Приготовление подложек

Подложки
должны быть достаточно тонкими, чтобы
они хорошо просвечивались электронным
пучком. Их толщина и плотность должны
способствовать рассмотрению деталей
и объектов, прочными, чтобы не разрушиться
под взаимодействием пучка электронов.

Подложки из
коллодия. Готовят 0,5 – 1,5 % раствор
коллодия в амилоцетате. Одну каплю этого
раствора наносят в чашку Петри с
дистиллированной водой.

Капли быстро
разбегаются по поверхности воды, образуя
очень тонкую пленку. На эту пленку
наносим металлические сеточки диаметром
до 3 миллиметров.

Затем с помощью
специального крючка вылавливаем сеточки
вместе с пленкой, помещаем их на
специальный столик. Даем возможность
пленке подсохнуть. На сеточки наносим
слегка опалесцирующую эмульсию
исследуемого объекта в дистиллированной
воде или в физиологическом растворе.
Препарат вновь подсушиваем, контрастируем
и микроскопируем.

Приготовленный
препарат вставляют в объектодержатель,
в микроскоп и микроскопируют.


1 – дифференцировать
вирусы по морфологическим признакам;

2 – производить
иммуноэлектронную микроскопию –
выявлять результаты взаимодействия
специфических корпускулярных или
внутриклеточных антигенов.

Применение
электронной микроскопии в диагностике
вирусных заболеваний содержится
ограниченной доступностью.В
высокоразрешающих электронных микроскопов
для лаборатории и сложностью их
технического обслуживания.

Окрашивание по Романовскому — Гимзе Информацию О

Окраска по Романовскому — Гимзе — цитологический метод окраски простейших, бактерий, клеточных структур и тканей различных видов (в том числе крови) при световой микроскопии.

Предложена в 1904 году Густавом Гимзой. Окрашивает ацидофильные образования в различные оттенки красного цвета, базофильные — в цвета от пурпурного до синего.

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Медицинский взгляд на еду
Adblock
detector