Предметные стекла для цитологических исследований || Предметные стекла для цитологических исследований

X. Методы окраски диагностических препаратов

Для окраски мазков, приготовленных
непосредственно из диагностического
материала (метод прямой микроскопии),
наиболее часто используется метод
Ziehl-Neelsen.

Однако при большом количестве
исследуемых ежедневно мазков в целях
ускорения процедуры микроскопии
практикуется использование люминесцентной
микроскопии.

— окраска фуксином (с подогреванием) —
при одновременном воздействии нагревания
и сильного протравливающего действия
карболовой кислоты повышается способность
красителя проникать в микробную клетку
и особенно в структуры ее клеточной
стенки, состоящей из липидов, миколовых
кислот и восков.

— обесцвечивание (3 мин) — последующая
обработка мазка 25% раствором серной
кислоты или 3% раствором солянокислого
спирта приводит к обесцвечиванию
красителя, проникшего в структуры, не
обладающие достаточной гидрофобностью
и стойкостью к разрушению в кислоте
(кислотоустойчивостью).

Только кислото-
и спиртоустойчивые микроорганизмы
стойко удерживают краситель и остаются
после обесцвечивания окрашенными в
малиново-красный цвет;

— контрастирующая окраска (1 мин.) —
обесцвеченные элементы мазка докрашивают
метиленовым синим для придания
контрастности препарату.


— бинокулярный микроскоп;

— иммерсионное масло;

— капельница для нанесения масла на
препарат;

— штатив с окрашенными и высушенными
мазками, которые должны быть расположены
в порядке номеров регистрации;

— емкость с ксилолом, спирто-эфирной
смесью или 70° спиртом;

— фильтровальная бумага для удаления
иммерсионного масла с поверхности
просмотренного препарата;

— коробки для хранения просмотренных
мазков;

— мягкая хлопчатобумажная ткань, бумажные
салфетки или марлевые тампоны для
протирания линз микроскопа;

— бумага и ручка для записи результатов
микроскопического исследования;


— емкость с дезинфицирующим средством.

Для исследования мазков, окрашенных по
Ziehl-Neelsen, используют световой бинокулярный
микроскоп с иммерсионным объективом
90х или 100х и окулярами 7х или 10х.

Собранный диагностический материал
должен как можно быстрее централизованно
доставляться в лабораторию. Доставка
должна осуществляется 1 или 2 раза в
неделю при условии обязательного
сохранения материала в промежутках
между доставками в холодильнике или с
применением консервантов.

Флаконы до
момента отправки хранятся в отведенном
для этих целей холодильнике или
специальном контейнере, который по
окончании каждого рабочего дня
опечатывается и запирается.

При работе с заразным материалом
необходимо иметь в виду, что работа с
диагностическим материалом является
одним из самых опасных этапов
микробиологического исследования.

Туберкулез распространяется
воздушно-капельным путем через содержащие
возбудитель мельчайшие аэрозольные
частицы, диаметр которых составляет
1-5 мкм.

Именно эти мельчайшие частицы
составляют ту фазу аэрозоля, которая
способна при дыхании проникать в легочные
альвеолы и оседать в них, формируя начало
инфекционного процесса.

В лабораторной
работе усилия должны быть направлены
на то, чтобы избежать или свести к
минимуму опасность заражения во время
тех манипуляций, при выполнении которых
наблюдается наибольшая вероятность
образования и рассеивания потенциально
опасных инфекционных аэрозолей.

В
лабораториях основными источниками
образования инфекционных аэрозолей
являются манипуляции, связанные с
обработкой зараженного материала


— приготовление мазков путем нанесения
материала на предметное стекло и
распределение его по поверхности стекла;

— прожигание над пламенем горелки
неочищенных от остатков материала
бактериологических петель;

— попытки фиксировать над горелкой
невысохший влажный мазок, что приводит
к вскипанию и разбрызгиванию частичек
материала;

— работа с жидкими культурами или с
надосадочной жидкостью;

— забор в пипетку суспензии микроорганизмов,
особенно при использовании автоматических
пипеток с фиксированным объемом жидкости;

— использование высокоскоростных
встряхивателей и центрифуг;

— энергичная инокуляция микробных
суспензий в пробирки или флаконы;

— повреждение пробирок при центрифугировании;


— использование ступок при растирании
инфицированного материала;

— приготовление суспензий микобактерий
для инокулирования (особенно опасно
использование ступок для растирания
культуры).

При выполнении всех этих манипуляций
следует соблюдать особую осторожность,
а некоторые желательно исключить из
лабораторных технологий.

Для предупреждения случаев
внутрилабораторного заражения необходимо
свести к минимуму возможность образования
аэрозолей. Для защиты лабораторных
работников от инфекционных частиц
необходимо проводить работу при
включенной локальной вытяжной вентиляции
(там, где это достаточно) или в специально
оборудованных боксах или ламинарных
шкафах.

Перед началом работы оборудование,
реактивы и материалы необходимо
разместить так, чтобы было удобно
работать и в дальнейшем стараться
соблюдать этот привычный порядок.

Все манипуляции по приготовлению мазков
из диагностического материала должны
быть стандартизованными, а для максимальной
безопасности все материалы и реагенты
всегда должны находиться на одних и тех
же постоянных местах и располагаться
в одном и том же порядке.

— Флаконы с поступившим в лабораторию
исследуемым материалом;

— Деревянные палочки (аппликаторы) или
бактериологические петли диаметром 3
мм для забора сгустков мокроты и
распределения их на стекле;

— Одноразовые предметные стекла
(обезжиренные, без царапин и сколов)
ГОСТ 9284-75;


— Несмываемый при окраске маркировочный
карандаш для нанесения идентификационного
номера на стекло (алмазный карандаш);

— Пинцет или щипцы для взятия предметных
стекол с мазками;

— Емкость (колба, эксикатор, стеклянная
банка и т.д.) с отмытым речным песком,
залитым техническим спиртом (70°), для
очистки бактериологической петли от
остатков материала перед очередной
стерилизацией ее в пламени горелки;

— Спиртовка или газовая горелка Бунзена
для прокаливания петли;

— Одноразовые или стерильные стеклянные
чашки Петри для отбора гнойных комочков
материала;


— Стерильные мерные пипетки на 10 мл и 5
мл для переноса мокроты в чашки Петри;

— Лотки (подносы), выстланные фильтровальной
бумагой, для просушивания приготовленных
мазков;

— Контейнеры для сбора и последующего
автоклавирования инфицированного
материала и загрязненной посуды;

— Ватные шарики для обработки загрязненных
поверхностей дезинфицирующим раствором.

— окраска фуксином (с подогреванием) —
при одновременном воздействии нагревания
и сильного протравливающего действия
карболовой кислоты повышается способность
красителя проникать в микробную клетку
и особенно в структуры ее клеточной
стенки.

состоящей из липидов, миколовых
кислот и восков. Обычные анилиновые
красители не проникают в клеточную
стенку микобактерий, и последние не
окрашиваются;

— обесцвечивание (3 мин.) — последующая
обработка мазка 25% раствором серной
кислоты или 3% раствором солянокислого
спирта приводит к обесцвечиванию
красителя, проникшего в структуры, не
обладающие достаточной гидрофобностью
и стойкостью к разрушению в кислоте
(кислотоустойчивостъю).

Только кислото-
и спиртоустойчивые микроорганизмы
стойко удерживают краситель и остаются
после обесцвечивания окрашенными в
малиново-красный цвет;

аурамин ОО
1,0 г

родамин С
0,1 г

вода дистиллированная
1000 мл

Каждый краситель растворяют отдельно
в 150-200 мл дистиллированной воды и помещают
в термостат при 37°С на 18-24 часа. Затем
растворы сливают в одну емкость и доводят
общий объем до 1000 мл.

Аурамин обладает канцерогенной
активностью, поэтому не следует допускать
попадания на кожу его порошка или
раствора.

концентрированная
соляная кислота 3 мл

этиловый спирт 96°
97 мл

Аккуратно добавить 3 мл концентрированной
соляной кислоты к 97 мл этилового спирта.

Предупреждение: осторожно вливайте
кислоту в спирт, но не наоборот.

метиленовый синий
хлорид 25 мг

вода дистиллированная
100 мл


В 100 мл дистиллированной воды растворить
25 мг метиленового синего хлорида.

Хранение растворов.

Написать на этикетке название раствора,
концентрацию, дату приготовления и срок
хранения. Растворы желательно хранить
в темной посуде при комнатной температуре
в течение 3 месяцев.

— стекла с фиксированными мазками
раскладывают на специальные штативы
«рельсы» для окраски так, чтобы они
не касались друг друга;

— мазки заливают раствором 1 на 1 час;

Предупреждение: нельзя нагревать мазки
и использовать полоски фильтровальной
бумаги.


— тщательно, но аккуратно промывают
мазки дистиллированной водой;

— обесцвечивают раствором 2 (солянокислый
спирт) в течение 3 минут;

— промывают дистиллированной водой;

— гашение фона осуществляют раствором
3 в течение 1 минуты. Если препарат имеет
интенсивную синюю окраску, можно очень
аккуратно повторно промыть его
дистиллированной водой;

— мазки высушивают при комнатной
температуре в вертикальном или наклонном
положении.

— растереть в ступке 0,3 г основного
фуксина с 2-3 каплями глицерина, добавить
по каплям 10 мл 96° этилового спирта.

— расплавить 5 г кристаллического фенола
путем легкого подогревания на водяной
бане (температура плавления фенола —
41°С). Добавить слегка подогретую
дистиллированную воду до объема 100 мл.

— в 90 мл раствора 2 добавить 10 мл раствора
1.


а) Раствор серной кислоты

К 75 мл дистиллированной воды осторожно
долить 25 мл концентрированной серной
кислоты, постепенно наслаивая ее по
стенкам сосуда. Смешать. Содержимое
нагреется.

11.2. Морфологические характеристики кислотоустойчивых микобактерий при окраске по методу Zlehl-Neelsen

Кислотоустойчивые микобактерии
туберкулеза имеют в длину примерно 1-10
мкм, в ширину — 0,2-0,6 мкм. Обычно они видны
в виде тонких изящных палочек, но иногда
можно обнаружить изогнутые или извитые
варианты.

При окраске карболовым фуксином
микобактерии туберкулеза выявляются
в виде тонких, слегка изогнутых палочек
малиново-красного цвета, содержащих
различное количество гранул.

Микроорганизмы,
располагающиеся по одиночке, парами
или в виде групп, хорошо выделяются на
голубом фоне других компонентов
препарата. Нередко бактериальные клетки
могут располагаться в виде римской
цифры «V».

Внутри отдельных микробных клеток могут
обнаруживаться участки более интенсивного
окрашивания, в результате чего они
похожи на «бусы», а более слабо
окрашенные участки могут быть видны в
виде «полос».

В препарате могут выявляться также
измененные коккоподобные кислотоустойчивые
формы возбудителя, округлые сферические
или мицелиеподобные структуры.

Однако
в случае обнаружения измененных форм
кислотоустойчивых микроорганизмов
положительный ответ должен быть
подтвержден дополнительными методами
исследования.

Некоторые другие микроорганизмы, не
относящиеся к M.tuberculosis, могут иметь
различные формы — от длинных палочек до
кокковидных форм с различной интенсивностью
окрашивания.

Различную степень кислотоустойчивой
окраски можно наблюдать не только у
микобактерий, но и у других микроорганизмов.
Это могут быть Rhodococcus, Nocardia, Legionella, а
также цисты Cryptosporidium и Isospora.

Быстрорастущие микобактерий могут
отличаться по степени кислотоустойчивой
окраски — при частичной потере
кислотоустойчивой окраски они приобретают
фиолетово-малиновый цвет.

XIII. Учет результатов микроскопического исследования

Количество кислотоустойчивых микобактерий
(КУМ), обнаруживаемых при микроскопическом
исследовании, является очень важным
информационным показателем, так как
оно характеризует степень эпидемической
опасности больного и тяжесть заболевания.

Поэтому микроскопическое исследование
должно быть не только качественным, но
обязательно и количественным. При
использовании объектива 90х или 100х и
окуляра 7х-10х (общее увеличение = 630-1000х)
используется следующая градация
результатов световой иммерсионной
микроскопии (см. Таблицу
2).

Результаты микроскопического исследования
отражаются в двух документах: в
лабораторном регистрационном журнале
учета микроскопических исследований
и на бланках, на которых результаты
исследования сообщаются в направившее
— материал лечебное учреждение.

Таблица
2

┌───────────────────┬───────────┬───────────────────┬───────────────────┐

│ Результат
│Минимальное│ Форма записи │
Интерпретация │


│ исследования
│число полей│ результата │
результата │

│ │ зрения
│ │ исследования │

│ │ (п/з),
│ │ │

│ │обязатель-
│ │ │

│ │ ных
для │ │ │


│ │ просмотра
│ │ │

├───────────────────┼───────────┼───────────────────┼───────────────────┤

│КУМ не обнаружены
в│ 300 │ ОТР │ Отрицательный

│ 300 п/з │
│ │ │

│ 1-2 КУМ в 300п/з │
300 │ Рекомендуется │ Результат
не │

│ │ │ повторить
│ оценивается │

│ │ │ исследование
│ │

│ 1-9 КУМ в 100 п/з │
100 │ «____» КУМ в ТПО │ Положительный

│ │ │ 100
п/з*
│ │


│10-99 КУМ
в 100 п/з│ 100 │ 1 **
│ Положительный │

│ 1-10 КУМ в 1 п/з │
50 │ 2 ** │ Положительный │

│ Более 10 КУМ в 1 │
20 │ 3 ** │ Положительный │

│ п/з │
│ │ │

└───────────────────┴───────────┴───────────────────┴───────────────────┘

──────────────────────────────

* Указать точное число КУМ


Точное число —
Единичные КУМ в препарате;

1 — Единичные
КУМ в поле зрения;

2 — Умеренное
количество КУМ;

3 — Значительное
количество КУМ;

14.4. Инспекционный контроль качества микроскопических исследований

Важным элементом обеспечения качества
выполняемых исследований является
регулярное осуществление внутрилабораторного
контроля качества микроскопических
исследований, который достигается
систематическим наблюдением за проводимой
в лаборатории работой и оценкой ее
эффективности.

— оценку качества поступающих проб;


— контроль за соблюдением рецептуры и
методики приготовления реагентов и
красителей;

а) приготовлении мазков (включая качество
предметных стекол);

б) окраске мазков;

в)проведении микроскопического
исследования;

г) учете и регистрации результатов.

— организации рабочих мест (приема и
регистрации материала, приготовления
и окраски мазков, микроскопирования);

— соблюдения правил и сроков хранения
реагентов и красителей;

— настройки оборудования;

— микроскопирования положительных и
отрицательных контрольных образцов;


— своевременности и точности передачи
результатов в учреждение, направившее
материал для исследования.

— регулярным его применением в лабораторном
подразделении;

— правильно обученными, заинтересованными
и ответственными работниками;

— рациональным применением регламентированных
методов;

— регулярным анализом допущенных ошибок
и немедленным их исправлением.

Одной из форм обеспечения качества
бактериоскопических исследований
является использование в ряду клинических
мазков двух Дополнительных не окрашенных
контрольных мазков, один из которых
заведомо является положительным, а
второй — отрицательным мазком.

Необходимо еженедельно и ежемесячно
обобщать и анализировать полученные
данные для определения процента
положительных результатов и, по
возможности, определять причины любых
резких отклонений от средних показателей.

Качество исследований обеспечивается
всеми сотрудниками лаборатории.

На территории Российской Федерации
функционирует Федеральная система
внешней оценки качества (ФСВОК) клинических
лабораторных исследований, которая
контролирует клинико-диагностические
и бактериологические лаборатории путем
заочной оценки качества с использованием
контрольных образцов.

Деятельность системы основана на
регулярной проверке правильности
выполняемых лабораторией исследований
и предоставлении информации о результатах
оценки их качества.

Участие в ФСВОК
является одним из основных видов
деятельности клинико-диагностических
и бактериологических лабораторий по
обеспечению требуемого качества
выполняемых исследований.

Внешняя оценка качества клинических
лабораторных исследований позволяет
своевременно выявить недостатки в
работе клинико-диагностических
подразделений, оказать
организационно-методическую и
консультативную помощь участвующим в
ФСВОК лабораториям, выработать адекватные
рекомендации по устранению обнаруживаемых
ошибок и совершенствованию используемых
методик.

Внешнюю оценку качества микроскопических
исследований для выявления кислотоустойчивых
микобактерий осуществляют совместно
с Центром внешнего контроля качества
клинических лабораторных исследований
Минздрава России федеральная и
региональные бактериологические
референс-лаборатории.

Инспекционный контроль (кураторские
визиты) имеет целью проведение текущей
оценки основных показателей работы
лаборатории и проверку достоверности
получаемых в ней результатов
микроскопического исследования путем
очной проверки деятельности лаборатории
при ее посещении представителями
лицензирующего органа и курирующей
лаборатории.

Кураторские визиты являются наиболее
эффективными методами оперативного
контроля качества лабораторной
диагностики в конкретном лабораторном
подразделении.

При исследовании мокроты пациентов с
подозрением на туберкулез понятие
«качественная мокрота» имеет
конкретное определение. Качественной
является свежевыделенная мокрота из
глубоких отделов дыхательных путей с
минимальными примесями слюны или
носоглоточной слизи.

Наилучшим для
исследования считают образец мокроты,
в котором имеются слизистые или
слизисто-гнойные комочки, белесоватые
включения. Сероватый, желтоватый или
бурый цвет мокроты также может
характеризовать качественный материал.

Индуцированная, т.е. полученная при
аэрозольных ингаляциях или других
манипуляциях, мокрота напоминает по
внешнему виду и консистенции слюну.
Важно, чтобы этот материал по ошибке не
был удален как непригодный для
исследования.

2.4. Правила работы с диагностическим материалом

В связи с высокой трансмиссивностью
микобактерий туберкулеза и, как следствие,
с высоким риском заболевания среди
сотрудников лабораторных подразделений
устройство лаборатории, расположение
и организация рабочих мест должны
предотвращать как развитие внутрибольничной
туберкулезной инфекции, так и контаминацию
рабочих мест, а также обеспечивать
необходимые меры безопасности при
работе персонала с возбудителем
туберкулеза.

б) инженерные (проектные и технические)
мероприятия, направленные на снижение
концентрации инфекционных аэрозолей
в воздухе (принудительная вентиляция,
использование эффективных устройств
обеззараживания воздуха и др.);

в) меры персональной защиты органов
дыхания персонала (защитные маски,
респираторы).

Защитные персональные маски типа
матерчатых или бумажных хирургических
предотвращают распространение
микроорганизмов, захватывая крупные
жидкие частицы около рта или носа, но
не обеспечивают защиту от вдыхания
подсохших капельных ядер аэрозолей.

Респираторы плотно прилегают к лицу,
предотвращая просачивание воздуха
через боковые отверстия. Медицинским
работникам противотуберкулезных
учреждений и лабораторий рекомендуется
использовать респираторы, обеспечивающие
95%-ную задержку аэрозольных частиц
диаметром 0,3 мкм.

Эффективность
респираторов снижается при увлажнении
и загрязнении, поэтому их хранят
завернутыми в чистую ткань, а не в
сохраняющих влагу пластиковых пакетах.

Во время работы двери в лабораторию
должны быть закрыты. Расположение
рабочих зон, оборудования и реагентов
должно быть постоянным и логичным — в
соответствии с последовательностью
выполнения работы и соблюдением
эпидемиологической цепочки.

Рабочие
помещения должны содержаться в чистоте
и обеззараживаться бактерицидными
лампами (не менее 40 минут перед началом
работы и в конце рабочего дня).

Столы
должны протираться раствором
соответствующего дезинфицирующего
средства (например 5% раствором хлорамина)*два раза в день — перед началом работы
и после ее окончания.

Эффективность
ультрафиолетовых облучателей зависит
от влажности и степени загрязненности
воздуха и рабочих поверхностей, что
необходимо учитывать при проведении
санитарных гигиенических мероприятий
в лаборатории.

У каждого рабочего места должны быть
вывешены методические инструкции по
проведению выполняемых на этом месте
рабочих процедур. Все манипуляции на
каждом рабочем месте должны выполняться
в строгом соответствии с инструкцией.

Любые изменения вносятся в эти документы
только по указанию заведующего
лабораторией и должны быть завизированы
его подписью с указанием даты изменения
методики.


Все документы должны храниться в течение
2 лет.

При организации микробиологических
исследований необходимо руководствоваться
санитарными правилами Российской
Федерации и помнить, что к работе с
возбудителем туберкулеза допускаются
учреждения, имеющие специальное
разрешение на работу с микроорганизмами
III-IV группы патогенности.

Это связано с
высоким риском заболевания среди
сотрудников микробиологических
подразделений. Устройство лаборатории,
расположение и организация рабочих
мест должны предотвращать как развитие
внутрибольничной туберкулезной инфекции,
так и контаминацию рабочих мест, а также
обеспечивать необходимые меры безопасности
при работе персонала с возбудителем
туберкулеза.

в) меры персональной защиты органов
дыхания персонала (защитные маски,
респираторы). Указанные меры приведены
в последовательности убывания их
эффективности.

Например, персональная
респираторная защита малоэффективна
при отсутствии административных мер и
мер, направленных на снижение концентрации
инфекционных аэрозолей в воздухе рабочих
помещений.

— образовательную подготовку персонала,
включающую представление о путях
трансмиссии микобактерий туберкулеза
и мерах профилактики;

— соблюдение правил сбора материала (в
первую очередь, мокроты);

— выбор методик, сокращающих время работы
с заразным материалом и повышающих
безопасность лабораторных манипуляций.


1) удаление и обмен воздуха в помещениях
путем естественной вентиляции, что
допустимо лишь для неинфицированных
помещений;

3) удаление или обеззараживание
инфекционного аэрозоля, находящегося
в воздухе помещений, с использованием
технических средств (фильтрация воздуха,
воздействие на микроорганизмы, приводящее
к их уничтожению и гибели).

Общая принудительная вентиляция
(приточная, вытяжная или приточно-вытяжная)
должна обеспечивать удаление загрязненного
(инфицированного) воздуха из помещения
и отсутствие в помещениях застойных
зон.

Локальная вентиляция должна обеспечивать
удаление инфицированного воздуха из
зоны роботы с инфекционным материалом
и поступление чистого (неинфицированного)
воздуха.

Она может осуществляться с
помощью локальных вытяжных зонтов,
колпаков, вытяжек и других технических
устройств. При работе с инфекционным
материалом локальные вытяжные установки
должны быть оснащены бактерицидными
фильтрами или другими устройствами,
предотвращающими выброс инфекционного
аэрозоля наружу.

Обеззараживание воздуха и системы
рециркуляции воздуха внутри помещений.
Системы обеззараживания воздуха должны
обеспечивать снижение концентрации
инфекционного аэрозоля в воздухе и
поддержание ее на заданном нормативными
документами уровне.

Устройства
обеззараживания воздуха могут
использоваться как в системе общей
вентиляции, так и в автономных устройствах
рециркуляции воздуха в помещении.

Их
использование должно осуществляться
в строгом соответствии с инструкциями.
Например, эффективность работы
ультрафиолетовых облучателей снижается
во много раз при облучении загрязненных
поверхностей, высокой влажности воздуха
(после влажной уборки).

При использовании фильтрующих устройств
необходимо контролировать состояние
фильтров и осуществлять их своевременную
замену и утилизацию. Кроме того, такие
устройства должны гарантировать высокую
эффективность фильтрации инфекционного
аэрозоля и во избежание возможности
вторичного попадания отфильтрованного
инфекционного аэрозоля в воздух помещения
должны работать непрерывно.

Устройства, инактивирующие микроорганизмы,
должны обеспечивать разрушение микробных
клеток в процессе обработки воздуха и
не оказывать отрицательного влияния
на воздушную среду, материалы, оборудование
и человека.

В связи с этим такие установки должны
иметь необходимые документы, разрешающие
их использование в противотуберкулезных
учреждениях, а также методическую
документацию по правилам эксплуатации
и рекомендации по их использованию в
помещении.

К числу таких систем относятся
шкафы биологической защиты (ламинарные
шкафы), фильтрующие или обеззараживающие
устройства и/или приборы, сочетающие
указанные функции.

Индивидуальная защита органов дыхания.
Защитные персональные маски типа
матерчатых или бумажных хирургических
предотвращают распространение
микроорганизмов, захватывая крупные
жидкие частицы около рта или носа, но
не обеспечивают защиту от вдыхания
подсохших капельных ядер аэрозолей.

Респираторы — это специальные виды масок
безопасности. Они плотно прилегают к
лицу, предотвращая просачивание воздуха
через боковые отверстия. Медицинским
работникам противотуберкулезных
учреждений и лабораторий рекомендуется
использовать респираторы, обеспечивающие
95%-ную задержку аэрозольных частиц
диаметром 0,3 мкм.

Эффективность
респираторов снижается при увлажнении
и загрязнении, поэтому их хранят
завернутыми в чистую ткань, а не в
сохраняющих влагу пластиковых пакетах.

При культуральном исследовании мазок и посев производятся обязательно из одной и той же порции материала. Это основное требование правильного микробиологического исследования

Микроскопическое исследование
производится только при наличии
письменного направления на исследование
от уполномоченных лиц.

Бланки направлений на исследование
хранятся отдельно от полученного
материала. Загрязненные бланки перед
регистрацией в лабораторном журнале
стерилизуются в сухожаровом шкафу или
(при отсутствии шкафа) проглаживаются
горячим утюгом.

Бланки направлений должны быть правильно
оформлены, а каждая полученная проба
диагностического материала правильно
промаркирована. Не следует производить
исследование безымянных проб или проб
с неправильно оформленными направлениями.

При регистрации необходимо оценить
качество пробы, чтобы отобрать и отделить
пробы, содержащие слюну. Ответ может
быть сформулирован следующим образом:
«Поступившая проба похожа на слюну.

Рекомендуется повторить сбор мокроты».
Диагностический материал в виде слюны
может быть исследован только при прямом
назначении врача в исключительных
случаях, когда другой диагностический
материал не может быть собран.

Для сокращения затрат времени на
оформление ответов можно использовать
резиновые штампы со стандартными
формулировками.

Протекшие или поврежденные флаконы с
материалом следует немедленно удалить,
подвергнуть автоклавированию и запросить
новую (повторную) пробу.

На бланке направления на исследование
необходимо отметить время доставки
материала в лабораторию и фиксировать
любые задержки в поступлении проб, что
имеет особое значение при отрицательных
результатах.

Следует указывать примерный объем
полученной для исследования пробы
мокроты.

— предотвращение просачивания содержимого
и загрязнения окружающей больного среды
чрезвычайно стойкими к физическим
воздействиям микобактериями и

— предохранение сохраняющегося во
флаконе исследуемого материала от
загрязнения широко распространенными
вегетирующими в окружающей среде
кислотоустойчивыми микобактериями.


— должны иметь плотно завинчивающиеся
или герметически закрывающиеся крышки;

— объем флаконов должен составлять 20-50
мл, что вполне достаточно для проведения
всех видов исследований;

— флаконы должны быть изготовлены из
прозрачного материала чтобы можно было
оценить количество и качество собранной
пробы, не открывая крышку;

— материал, из которого изготовлены
флаконы, должен легко подвергаться
маркировке и надежно сохранять ее на
всем протяжении периода хранения,
транспортировки и проведения исследования.

При отсутствии одноразовых контейнеров
можно применять толстостенные флаконы
из стекла (карманные плевательницы).

При многоразовом использовании флаконы
стерилизуют в автоклаве, удаляют остатки
содержимого, тщательно моют, помещают
в них стеклянные бусы для гомогенизации
мокроты и повторно стерилизуют.

Примененяя флаконы многоразового
пользования, во избежание лабораторного
загрязнения диагностического материала
лаборатория должна постоянно контролировать
качество мытья и стерилизации флаконов.

Реактивы и красители

Все флаконы с реактивами и красителями
заводского производства должны иметь
отметку о дате получения и вскрытия
заводской упаковки. Любые некачественные
материалы следует специально помечать
и немедленно удалять из лаборатории.

В лаборатории или на складе следует
иметь запас реактивов и расходных
материалов на 6 месяцев работы.

— микроскоп бинокулярный световой ГОСТ
15150-69;

— микроскоп люминесцентный ГОСТ 15150-69;

— спиртовка со стеклянным колпачком или
горелка Бунзена;

— баллон с бутаном;


— облучатель бактерицидный потолочный;

— аквадистиллятор;

— вытяжной шкаф лабораторный;

— весы для химических реактивов с
точностью до 0,01 г — ГОСТ 24104-80;

См. ГОСТ 24104-2001 «Весы
лабораторные. Общие технические
требования», введенный в действие с
1 июля 2001 г. постановлением Госстандарта
РФ от 26 октября 2001 г. N 439-ст

— капельница для нанесения иммерсионного
масла на препарат;

— петля бактериологическая нихромовая
с петледержателем;


— подставка («рельсы») для фиксации
и окраски мазков;

— лотки (подносы) для сушки неокрашенных
мазков;

— штативы для сушки мазков в вертикальном
или наклонном положении;

— емкость с отмытым речным песком и 70°
спиртом для очистки бактериологических
петель;

— коробки для хранения стекол, картонные
или металлические, на 12-25 стекол;

— таймер на 0-60 минут;

— пинцеты анатомические или щипцы для
взятия предметных стекол;


— ножницы из нержавеющей стали;

— градуированные цилиндры;

— фарфоровые ступки с пестиками;

— колбы разной емкости;

— пипетки на 1, 2, 5, 10 мл;

— темные флаконы стеклянные или пластиковые
для хранения красителей;

— флаконы с капельными дозирующими
трубками для нанесения красителей на
препарат;


— флаконы для сбора проб диагностического
материала;

— контейнеры (транспортировочные ящики)
для транспортировки проб;

— планшеты для транспортировки мазков;

— чашки Петри одноразовые пластиковые
диаметром 90 мм;

— предметные (оптические препаративные)
стекла 25 мм х 75 мм, толщиной 1,1-1,3 мм — ГОСТ
9284-75;

— масло иммерсионное — ГОСТ 13739-78 — с
показателем преломления = 1,515;

— штативы для предметных стекол, на 12-25
стекол;


— контейнер для отработанных заразных
материалов;

— контейнер пластмассовый для бумажного
мусора;

— вата белая гигроскопическая или
марлевые салфетки;

— одноразовые перчатки;

— лабораторные халаты;

— маски;

— бумажные полотенца, одноразовые;


— ручки, шариковые, с красными чернилами;

— ручки, шариковые, с черными или синими
чернилами;

— восковой карандаш или несмываемый
маркер;

— фильтровальная бумага N 1;

— ткань для протирания линз;

— бланки направления на микроскопическое
исследование;

— лабораторный журнал;


— лабораторные бланки для ответов.

— спирт этиловый 96° марки ОП-2;

— кислота соляная концентрированная —
ГОСТ 3118-77;

— кислота серная концентрированная —
ГОСТ 4204-77;

— вода дистиллированная — ГОСТ 6709-72;

— ксилол — ГОСТ 25828-83;


— бумага индикаторная универсальная —
ТУ 6-09-1181-76;

— фуксин основной ТУ 6-093804-74;

— фенол кристаллический (карболовая
кислота) — ГОСТ 6417-72;

— метиленовый синий хлорид — ТУ 6-09945-75;

— глицерин — чда — ГОСТ 6259-75;

— аурамин ОО (аурамин О, Sigma);

— родамин С-ТУ 6-09-2463-77;


— акридиновый оранжевый C.I.46005;

— перманганат калия — ГОСТ 10163-76.

— 5% раствор хлорамина или

— 5% раствор фенола или

— 5% раствор гипохлорита.

Приложение
N 2

к
Инструкции
по унифицированным методам

микроскопических
исследований

для
выявления кислотоустойчивых микобактерий

в
клинико-диагностических лабораториях

лечебно-профилактических
учреждений

Сопроводительный
лист при транспортировке

диагностического
материала в микроскопическую лабораторию

(заполняется
в 2-х экземплярах)

Учреждение
отправитель _____________________________________________

Адрес
__________________________________ тел: ______________________


Учреждение
получатель ______________________________________________

Адрес
_____________________________________ тел: ___________________

┌─────┬─────────────────────────────────┬─────────┬──────────┬──────────┐

│N п/п│ Фамилия,
имя, отчество пациента │Материал │Дата
сбора│Примечание│

├─────┼─────────────────────────────────┼─────────┼──────────┼──────────┤

│ 1. │
│ │ │ │


│ 2. │
│ │ │ │

│ 3. │
│ │ │ │

│ 4. │
│ │ │ │

│ 5. │
│ │ │ │

│ 6. │
│ │ │ │

│ 7. │
│ │ │ │

│ 8. │
│ │ │ │


│ 9. │
│ │ │ │

│ 10. │
│ │ │ │

│ 11. │
│ │ │ │

│ 12. │
│ │ │ │

└─────┴─────────────────────────────────┴─────────┴──────────┴──────────┘

Итого:
_____________________________________________________________

Подпись
ответственного лица:
__________________(___________________)


Дата и время
отправления материала:
_______________________________

Материал сдал:
______________________ Материал принял: _____________

Дата и время
получения материала
___________________________________

Приложение
N 3

— Раковина или специальный вместительный
лоток для проведения окраски;


— Специальный штатив («рельсы») для
окраски мазков на предметных стеклах;

— Металлический стержень с ватным
тампоном, который используется вместо
горелки для подогревания препарата при
окрашивании карболовым фуксином;

— Фильтровальная бумага размером ~ 4 х
1,5 см. для окраски мазков карболовым
фуксином;

— Раствор карболового фуксина;

— 25% раствор серной кислоты или

— 3% раствор солянокислого спирта;


— Дистиллированная вода для промывания
мазков;

— 0,3% раствор хлорида метиленового синего;

— Штатив для просушивания окрашенных
стекол на воздухе в вертикальном или
наклонном положении.

— Кислота серная концентрированная,
ГОСТ 4204-77;

— Фенол кристаллический, ГОСТ 6417-72;

— Фуксин основной, ТУ 6-09-3804-82;


— Глицерин, ЧДА, ГОСТ 6259-75;

— Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72;

Через правильно приготовленный мазок можно читать газетный шрифт, расположенный позади стекла на расстоянии 5-10 см.

При окраске мазков не следует помещать
на штатив («рельсы») и окрашивать
одновременно более 12 стекол. Соприкосновение
стекол боковыми краями может привести
к переносу краски и микобактерий с
одного стекла на соседние..

В процессе окраски мазков при их
промывании проточной водой не следует
пользоваться резиновыми трубками или
наконечниками для направления струи
воды на препарат.

В окружающей среде и
водопроводной воде содержится значительное
количество кислотоустойчивых сапрофитов,
которые легко размножаются на резиновых
поверхностях в условиях повышенной
влажности.

В число исследуемых мазков, подлежащих
окрашиванию необходимо ежедневно
включать контрольные неокрашенные
положительный и отрицательный препараты.
Вначале микроскопируют контрольные
мазки, а затем — мазки от больных.


— в положительном контрольном мазке
микобактерии не окрашены в красный
цвет;

— в отрицательном контрольном мазке
после обесцвечивания видны красные
клетки;

— не произошло достаточного обесцвечивания
фона.

— в положительном контрольном мазке не
обнаруживаются ярко окрашенные
бактериальные клетки или они имеют
тусклую флюоресценцию;

— отрицательные контрольные мазки
содержат флюоресцирующие объекты;

— фон недостаточно темный или имеет
флюоресцентное свечение.

При этом чаще всего используется та же
пипетка, которой производился посев. С
помощью этой пипетки на стекло наносят
1-2 капли осадка, который распределяют
тонким слоем в центре стекла на площади
1 см х 2 см.

1. Оставшийся после посева осадок
встряхивают, забирают в пипетку.


2. 1-2 капли осадка наносят на предметное
стекло, формируя мазок размером ~ 1 х 2
см.

3. Мазок из осадка жидких материалов
(моча, промывные воды и др.) во избежание
смывания материала при окраске желательно
приготавливать на стеклах, предварительно
обработанных яичным белком.

При приготовлении мазка для микроскопического
исследования необходимо добиваться
правильной его толщины. Если мазок
слишком тонкий и содержит мало материала,
при микроскопическом исследовании
можно получить ложноотрицательный
результат.

Если мазок слишком толстый, это затрудняет
его фиксацию, материал недостаточно
плотно прикрепляется к стеклу и может
быть частично или полностью удален при
окраске.

Не рекомендуется готовить мазки способом
«растяжки» материала между двух
предметных стекол. Такой способ
сопровождается образованием биологически
опасного аэрозоля.

Ограниченная площадь мазка (~ 1 см х 2 см
в центре стекла) значительно повышает
безопасность манипуляции и последующей
микроскопии, так как периферические
части и ребра предметного стекла остаются
незагрязненными инфекционным материалом.

Приготовленные вышеуказанным способом
мазки помещают на 15-30 минут на лотки
(подносы), выстланные фильтровальной
бумагой, и высушивают при комнатной
температуре в вытяжном шкафу или при
отсутствии такового — на столе, в
специально отведенном месте.

При окраске по Ziehl-Neelsen стекла с высохшими
мазками пинцетом или специальными
щипцами берут за конец, на который
нанесена маркировка, и трижды медленно
проводят через верхнюю треть пламени
спиртовки или газовой горелки до
исчезновения признаков запотевания
стекла.

Общая продолжительность
пребывания мазка в пламени не должна
превышать 3-5 секунд. Затем стекла помещают
на специальную подставку («рельсы»)
для окрашивания.

При окраске мазков флюорохромными
красителями рекомендуется фиксация в
сухожаровом шкафу при 85°С в течение 45
минут. Однако при отсутствии такой
возможности допускается фиксация над
пламенем горелки.

В плане охраны труда оптимальным является
метод, предложенный A.Hain. Этот метод
фиксации мазков используется как при
окраске по Ziehl-Neelsen, так и люминесцентными
красителями.

Согласно этому методу,
предметные стекла с мазками раскладывают
на жестяные или эмалированные подносы
и помещают в сушильный шкаф, где сначала
высушивают при 37°С.

Затем температуру
повышают до 105°С и, спустя 10 минут, шкаф
выключают. При таком методе достигается
надежное прикрепление материала к
стеклу и гибель микобактерий, как
находящихся в материале мазка, так и
случайно попавших на поднос.

Высушенные и фиксированные мазки должны
сразу же окрашиваться. Нефиксированные
мазки ни в коем случае не должны
оставляться открытыми на ночь, так как
это увеличивает опасность распространения.

Фильтровальная бумага, которой был
выстлан лоток (поднос), по окончании
фиксации каждой серии мазков подлежит
обязательному сжиганию или автоклавированию,
а лоток обжигается спиртом. Лотки
ежедневно выстилаются чистой бумагой.

Выдача ответов и администрирование

Результаты микроскопического исследования
следует передавать в медицинское
учреждение или непосредственно врачу,
направившему материал на исследование.

Результаты бактериоскопии следует
отсылать как можно быстрее — желательно
в течение 24 часов с момента получения
проб мокроты.


Необходимо еженедельно и ежемесячно
обобщать полученные данные для ведения
статистики исследований.

* Дезинфицирующие средства, используемые
в лабораториях в противотуберкулезных
целях, содержат фенолы, гипохлориты,
спирт, формальдегиды, йодофоры и
глутаральдегиды.

Целый ряд распространенных дезинфектантов
обладают незначительной или не обладают
вовсе микобактерицидной активностью,
а средства на основе четвертичного
аммония неэффективны в рекомендуемых
концентрациях.

Приложение
N 1

Текст

Смотреть все

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРЕДМЕТНЫХ СТЕКОЛ ДЛЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ(71) Заявитель Учреждение образования Гомельский государственный медицинский университет(72) Авторы Надыров Эльдар Аркадьевич Никонович Сергей Николаевич(73) Патентообладатель Учреждение образования Гомельский государственный медицинский университет(56) .19961997. .,1996, .64.

Обработка стекол для микроскопии. Найдено на //// 20051111060045////(57) Способ подготовки предметных стекол для цитологических исследований, включающий погружение стекол в водный раствор хромокалиевых квасцов и сушку, отличающийся тем, что используют раствор, полученный путем растворения 1,0-1,3 г агарозы в 500 мл воды, нагрева до 100 С с добавлением 0,25-0,50 г хромокалиевых квасцов при постоянном помешивании, добавления 50-100 мг тимола и фильтрации, предметные стекла,предварительно обезжиренные и высушенные, погружают в нагретый раствор на 1-2 сек и сушат в вертикальном положении при комнатной температуре не менее часа.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для приготовления мазков-отпечатков, в том числе и для срочного интраоперационного исследования в практике клинической цитологии.

Для приготовления мазков-отпечатков используют обычные предметные стекла, которые перед использованием обезжиривают в жидкости Никофорова при комнатной температуре 1.

Недостатками являются отсутствие гистотопографических соотношений изучаемых морфологических структур в мазке-отпечатке, так как к стеклу в первую очередь прикрепляются клетки и неклеточные структуры, имеющие наименьшие межмолекулярные связи низкая информативность способа для диагностики злокачественных и доброкачественных опухолей с преобладанием фиброзного компонента смывание части материала с поверхности предметного стекла при фиксации и окрашивании в растворах красителей, что значительно ухудшает качество цитологических препаратов 11400 1 2008.12.

30 меньшая информативность при сравнении с гистологическими методами исследования. Известен способ подготовки предметных стекол, который применяется при иммуногистохимических исследованиях.

Его суть заключается в покрытии предметных стекол адгезивами, к которым относятся органосилан, полилизин или растворы, включающие в свой состав желатин.

Согласно этому способу готовят раствор из 2,5 г желатина, 2,0 г калийхромовых квасцов и 500 мл дистиллированной воды, полученный раствор нагревают до 60 С при постоянном помешивании, фильтруют, предметные стекла, предварительно обезжиренные и высушенные, погружают в раствор на 1-2 сек, сушат в вертикальном положении при комнатной температуре 2.

Недостатками прототипа являются дополнительное фоновое окрашивание мазка-отпечатка высокая стоимость реактивов поддержание постоянной температуры 60 С трудновыполнимо приготовленный раствор требует хранения в герметичной емкости при температуре 4 С и не более 3 месяцев Задача, на решение которой направлено предполагаемое изобретение, состоит в создании способа подготовки предметных стекол для цитологических исследований, обеспечивающего надежную и прочную фиксацию клеток и неклеточных структур из исследуемого очага на предметном стекле с целью определения характера патологического процесса.

Задача решается за счет того, что способ подготовки предметных стекол для цитологических исследований, включающий погружение стекол в водный раствор хромокалиевых квасцов и сушку, причем используют раствор, полученный путем растворения 1,01,3 г агарозы в 500 мл воды, нагрева до 100 С с добавлением 0,25-0,50 г хромокалиевых квасцов при постоянном помешивании, добавления 50-100 мг тимола и фильтрации,предметные стекла, предварительно обезжиренные и высушенные, погружают в нагретый раствор на 1-2 сек и сушат в вертикальном положении при комнатной температуре не менее часа.

Приготовленный раствор без изменения свойств может храниться в герметичной таре не менее 10-12 месяцев. Для приготовления мазков-отпечатков с операционного материала предметные стекла прикладывают к патологическому очагу.

При этом на стекле остаются отпечатки приставших к нему клеток и неклеточных структур с частичным сохранением их гистотопографических соотношений, что особенно важно при экспресс-диагностике злокачественных опухолей с преобладанием фиброзного компонента.

Далее предметные стекла высушивают, фиксируют по общепринятым методикам и окрашивают различными красителями, после чего выполняют цитологический анализ материала и постановку диагноза.

Пример Первоначально к 500 мл дистиллированной воды добавили навеску агарозы массой 1,3 г. Раствор нагрели до температуры 100 С до полного растворения агарозы при постоянном помешивании стеклянной палочкой, в раствор добавили 0,4 г хромокалиевых квасцов, перемешивали до полного растворения квасцов.

После чего добавили 75 мг тимола,размешали и отфильтровали раствор с использованием бумажного фильтра. Стекла,предварительно обезжиренные спирто-эфирной смесью, и высушенные окунали в свежеприготовленный раствор после чего высушили в вертикальном положении в течение 2 часов при комнатной температуре.

Приготовленные предлагаемым способом стекла использовали для приготовления мазков-отпечатков с тканей опухоли молочной железы, имеющей скиррозное строение.

Для сравнения качества мазков-отпечатков использовали стекла, приготовленные традиционным способом обезжиренные спирто-эфирной смесью и высушенные при комнатной температуре.

2 11400 1 2008.12.30 Подготовленные стекла приложили к срезам опухоли молочной железы (медкарта 386/24). Стекла окрасили, провели цитологический анализ с включением таких показателей, как количество кластеров в поле зрения, количество клеток в кластере.

В результате мазок-отпечаток на стеклах, подготовленных по предлагаемому способу, имел на 10 больше кластеров, чем мазок-отпечаток, подготовленный по стандартной методике.

Количество клеток в кластере на стеклах, приготовленных по предлагаемому способу, оказалось на 15 больше, чем на мазках-отпечатках, подготовленных традиционным способом.

Предлагаемый способ подготовки предметных стекол дает возможность повысить информативность цитологических исследований операционного материала, в том числе срочных интраоперационных биопсий, что достигается высокой адгезией клеток и неклеточных структур на поверхности предметного стекла с сохранением органотипического строения.

Источники информации 1. Полонская Н.Ю., Егорова О.В. Основы цитологической диагностики и микроскопическая техника. — М. Издательский центр Академия, 2005. — 160 с. 2. .1996-1997/ ,. 1996, . 64.

МПК / Метки

МПК: G02B 21/34

Метки: подготовки, предметных, стекол, способ, исследований, цитологических

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Медицинский взгляд на еду
Adblock
detector