Окраска цитологических препаратов

1) Вида и состава красителя;

2) Концентрации красителя, которая не всегда определяет красящую способность;

3) Продолжительность окраски;

4) Возраста окрашиваемого препарата. Препараты от 6 часов и до нескольких дней давности в большинстве случаев теряют мелкие структуpные тонкости;

5) pH среды оказывает сильное влияние на окрашиваемость и тон окраски. По-видимому безразлично каким способом добавляют pH-ионы, важна лишь их концентрация;

6) Не обнаружено никаких различий окрашиваемости от температуры холодильника до комнатной температуры.

а) наглядные
пособия

таблицы:

  1. Оптическая схема
    биологического микроскопа
    (1);

  2. Биологический
    световой микроскоп (2);

  3. Схема микротома
    (3);

  4. Электронный
    микроскоп (4);

  5. Строение клетки
    при световой микроскопии (5);

  6. Нуклеиновые
    кислоты в клетке (6).

1.
Почка
крысы.
Окраска гематоксилином и эозином.

техника приготовления и окраски цитологических препаратов


2.
Кровь лягушки.
Окраска гематоксилином и эозином.

3. Печень аксолотля.
Окраска гематоксилином и эозином.

Технические
средства обучения:

  1. Батарея со спиртами
    восходящей концентрации;

  2. Ксилол, кашица,
    парафины;

  3. Микротомы (санный,
    ротационный);

  4. Микротомный нож;

  5. Батарея для
    депарафинизации и окраски срезов;

  6. Набор красителей;

  7. Предметные и
    покровные стекла;

  8. Микроскопы.

III. Учебная информация для использования на занятии.

  1. Организационно-методические
    указания по подготовительной части
    самостоятельной работы.

При подготовке к
практическому занятию используется
рекомендованная учебная литература
(см. Раздел III.
Учебно-материальное обеспечение,
литература), а также учебно-методическое
пособие для самостоятельных занятий
по общему курсу гистологии и таблицы
(см. Раздел III.
Учебно-материальное обеспечение).

  1. Методические
    указания студентам по реализации
    целевых установок подготовки к занятию.

В первую очередь
студентам следует последовательно
изучить устройство светового микроскопа,
выделить его составные части, их функции
и уяснить правила микроскопирования.

Затем подробно ознакомиться с имеющимися
на лотке батареей для заливки биологического
материала в парафин (спирты возрастающей
концентрации; ксилол; парафин;

биологический
объект, залитый в парафин и наклеенный
на деревянную колодку), предметным и
покровными стеклами, предметным стеклом
с наклеенными на него срезами, различными
красителями.

При разборе
учебного материала на первом часе
занятия студент должен быть готов
принять участие в дискуссии, задавать
вопросы, требующие разъяснения,
преподавателю.

На втором часе занятия
САМОСТОЯТЕЛЬНО, под контролем
преподавателя, работает со световым
микроскопом: «отыскивает свет» и «наводит
на фокус» при слабом и сильном увеличении
микроскопа; изучает микропрепарат под
слабым и сильным увеличением.

1.
Почка
крысы.
Окраска гематоксилином и эозином.

Снаружи почка
покрыта сединительнотканной
капсулой,
которая не всегда есть на препаратах.
Далее расположено корковое
вещество почки.
В нем присутствуют почечные
тельца, имеющие округлую форму, и
поперечно срезанные просветы извитых
канальцев.

Мозговое
вещество состоит
оно из продольно перерезанных
канальцев-трубочек, идущих в одном
направлении, почечные тельца в нем
отсутствуют. Между канальцами в прослойках
соединительной ткани лежат кровеносные
сосуды с эритроцитами.

2.
Кровь лягушки.
Окраска гематоксилином и эозином.

Рассмотрите под
микроскопом препарат крови лягушки,
обратите внимание на окраску цитоплазмы
и ядер эритроцитов, их форму, количество.
Цитоплазма окрашена эозином в розовый
цвет, ядра вытянутой, овальной формы,
окрашиваются гематоксилином в
темно-фиолетовый цвет.

3. Печень
аксолотля. Окраска гематоксилином и
эозином.

Среди позвоночных
животных хвостатые амфибии имеют
наиболее крупные клетки. Поэтому этот
препарат является очень удобным объектом
для знакомства с животной клеткой.

Печеночные клетки (гепатоциты)
имеют на срезе вид многоугольников. Их
цитоплазма окрашена в розовый цвет.
Ядра клеток
округлые, фиолетового цвета.

Внутри
ядер видны глыбки хроматина и два розовых
ядрышка.
Между печеночными клетками рассеяны
пигментные
клетки,
цитоплазма которых заполнена гранулами
бурого пигмента — меланина.

  1. Какая часть
    микроскопа дает истинное, увеличенное
    и обратное изображение объекта? Что
    обеспечивает тонкую настройку
    микроскопического изображения?

Ответ: 1 – объектив;
2 – микровинт.

  1. Для чего в микроскопе
    нужно зеркало? Какая его сторона
    используется при точечном источнике
    освещения?

Ответ: 1 – позволяет
направлять световые лучи на объект; 2 –
плоская.

  1. Какие красители
    являются специфическими при окраске
    жировой ткани? Нервной ткани? Эластических
    волокон?

Ответ: 1 – судан
III;
2 – азотнокислое серебро; 3 – орсеин.

II.
Бланки служебных документов (образцы
рисунков к практическому занятию
спрашивать у лаборанта кафедры
гистологии).

  • Гистология,
    цитология и эмбриология: Учебник / Ю.И.
    Афанасьев, С.Л. Кузнецов, Н.А. Юрина, Е.Ф.
    Котовский и др.; Под ред. Ю.И. Афанасьева,
    С.Л. Кузнецова, Н.А. Юриной. — 6-е изд.- М.:
    Медицина, 2006.- 768 с.

  • Гистология. Атлас
    для практических занятий: учебное
    пособие для студентов медицинских
    вузов / Н.В. Бойчук, Р.Р. Исламов, С.Л.
    Кузнецов, Ю.А. Челышев. — М.: ГЭОТАР-Медиа,
    2008.- 160 с.

  • Атлас по гистологии,
    цитологии и эмбриологии / С.Л. Кузнецов,
    Н.Н. Мушкамбаров, В.Л. Горячкина. — М.:
    МИА, 2002. — с.

ПОДРОБНЕЕ:   Цитологическая картина коллоидного узла щитовидной железы что это — LiveAcademy

Схема ускоренной окраски гематоксилин-эозином, разработанной в МНИОИ им. П. А. Герцена

Отечественными цитологами (А. В. Руденко
и Л. К. Куница)  предложены модификации метода, в которых компоненты заменены на более доступные (например, светлый зеленый заменен на  бриллиантовый зеленый).

При окраске по Папаниколау в модификации А. В. Руденко и Л. К. Куницы мазки вначале окрашивают гематоксилином, хорошие результаты получены при использовании гематоксилина Бемера.

Физический
метод

Химический
метод

Фиксация
мазка над пламенем спиртовки в течение
нескольких секунд мазком вверх

Мазок
погружают в фиксатор на определенное
время. В качестве фиксатора используют:
этанол – 10-15 мин; ацетон – 5 мин; смесь
Никифорова (этанол эфир – 1:1) – 10-15
мин и др.

Простые
методы (ориентировочные)

Сложные
методы (дифференцирующие)

1.
Применяют для изучения морфологии
микроорганизмов.

2.
Окрашивают одним красителем анилино-вого
ряда (основным или кислым): кислый
фуксин, метиленовый синий, эозин,
генциановый фиолетовый.

1.
Применяют для изучения структуры
клеток, дифференциации микроорганизмов.

2.
Используют несколько красителей.
Окраска по методу: Грама, Циля-Нильсена,
Ожешко, Романовского-Гимза, Нейссера
Гинса-Бурри и др.

Преимущественно
для окраски микроорганизмов используют
основные красители. Краситель наливают
на поверхность мазка на определенное
время, затем мазок промывают до тех пор,
пока струи воды не станут бесцветными,
осторожно высушивают фильтровальной
бумагой.

Окраска
по Граму. Сущность метода

Метод
основан на способности микроорганизмов
удерживать образующийся при окраске
комплекс генцианового фиолетового и
йода. Это связано с особенностями
строения и химического состава
грамположительных и грамотрицательных
бактерий.

У грамположительных бактерий
на поверхности клеток есть магниевые
соли рибонуклеиновой кислоты, которые
прочно связывают комплекс генцианового
фиолетового с йодом и препятствуют его
вымыванию спиртом.

Кроме того,
грамположительные бактерии имеют более
выраженный пептидогликановый слой, в
котором после обработки спиртом сужаются
поры, что также делает невозможным
вымывание красителя.

У
грамотрицательных бактерий отсутствуют
магниевые соли рибонуклеиновой кислоты,
пептидогликановый слой значительно
тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при
обработке спиртом краситель легко
вымывается, бактерии обесцвечиваются
и при использовании дополнительного
красного красителя грамотрицательные
бактерии окрашиваются в красный цвет.

Методика
окраски по Граму (этапы
окраски по Граму представлены на
стенде).

  1. На
    фиксированный мазок наносят
    карболово-спиртовой раствор генцианового
    фиолетового на 1-2 минуты, затем краситель
    сливают.

  2. Наносят
    раствор Люголя на 1 мин.

  3. Обесцвечивают
    препарат этиловым спиртом в течение
    30-60 секунд до прекращения отхождения
    фиолетовых струек красителя.

  4. Препарат
    промывают водой.

  5. Мазок
    докрашивают водным раствором фуксина
    в течение 1-2 минут, промывают водой и
    высушивают фильтровальной бумагой.

Окраска
по Цилю-Нильсену

Применяют
для дифференциации кислотоустойчивых
и некислотоустойчивых микроорганизмов.
Кислотоустойчивость бактерий обусловлена
повышенным содержанием в клеточной
стенке и цитоплазме липидов, воска и
оксикислот.

Принцип основан на том, что
кислотоустойчивые бактерии за счет
содержания указанных веществ прочно
связывают карболовый фуксин при
нагревании (т.е.

окрашиваются в красный
цвет) и не обесцвечиваются кислотой.
Некислотоустойчивые бактерии
обесцвечиваются серной кислотой и при
использовании дополнительного красителя
— метиленового синего – окрашиваются
в синий свет.

Методика
окраски по Цилю-Нильсену:

  1. На
    фиксированный препарат – мазок нанести
    карболовый раствор фуксина через
    полоску фильтровальной бумаги и
    подогреть до появления паров в течение
    3-5 мин.

  2. Снять
    бумагу, промыть мазок водой.

  3. Нанести
    5 % раствор серной кислоты на 1-2 мин до
    обесцвечивания.

  4. Промыть
    водой.

  5. Докрасить
    мазок водным раствором метиленового
    синего в течение 3-5 мин.

  6. Промыть
    водой, высушить, микроскопировать.

Окраска
по Ожешко

Метод
основан на принципе окраски кислотоустойчивых
бактерий. Отличие заключается в
предварительной обработке микроорганизмов
0,5 % раствором соляной кислотой, что
облегчает окраску спор карболовым
фуксином. Споры
кислотоустойчивы, поэтому красятся в
красный цвет.

Методика
окраски по Ожешко:

  1. На
    нефиксированный мазок нанести 0,5 %
    раствор соляной кислотой и подогреть
    на пламени в течение 2-3 мин.

  2. Кислоту
    слить, препарат промыть водой, просушить
    и фиксировать над пламенем. Затем
    окрасить по Цилю-Нильсену. Споры
    бактерий приобретают красный цвет, а
    вегетативные формы — синий.

Окраска
по Романовскому-Гимзе

Краска
Романовского-Гимзе состоит из метиленового
синего, эозина и азура.

  1. На
    мазок наносят рабочий раствор красителя
    (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной
    воды) на 10-20 мин.

  2. Препарат
    промывают водой и высушивают на воздухе.

ПОДРОБНЕЕ:   Цитологический метод исследования опухоли

Трепонемы
окрашиваются в бледно-розовый цвет,
боррелии — в фиолетовый цвет, лептоспиры
— в розовый цвет.
Сапрофитные (непатогенные) формы
окрашиваются в синий цвет.

Морфологию
спирохет изучают также в живом состоянии
в фазово-контрастном или темнопольном
микроскопе. Хорошим методом выявления
спирохет является серебрение по Морозову.

к
работе № 3

Окраска гематоксилин-эозином, ускоренная методика.

1. Мазки погружают в

смесь Никифорова
на 15 минут.

2. Спирт этиловый 70° 2—3 мин,

3. Спирт этиловый 50° 2—3 мин,

4. Вода дистиллированная 1 мин.

5. Краска гематоксилин (по Эрлиху).7-20 мин.
В зависимости от зрелости краски

6. Вода водопроводная 3 мин.

7. 1% раствор соляной кислоты на 70% спирте

~ 1 сек  До побурения препарата

8. Вода водопроводная

Прополоснуть, до посинения препарата

9. Высушить фильтровальной бумагой

10. Спирт этиловый 70° 1 мин.

11. Спирт этиловый 90° 1 мин.

12. Спирт этиловый 96° 1 мин.

13. 0,5—1% спиртовый (96°) раствор эозина  1—2 мин.

14. Спирт этиловый 96° 10—20 сек.

1. Устройство светового микроскопа

Микроскоп –
оптический прибор, позволяющий получать
увеличенное изображение объекта, что
достигается двумя системами оптических
линз: непосредственное увеличение
объекта дает объектив, а затем первичное
изображение объектива вторично
увеличивается при помощи окуляра. На
рис.

1 показана упрощенная схема хода
лучей в микроскопе. Объектив, как видно
из этой схемы, дает истинное, увеличенное
и обратное изображение объекта.

Окуляр,
оставляя это изображение обратным, еще
более его увеличивает и переводит в
мнимое. Последнее обстоятельство на
практике значения не имеет, но то
обстоятельство, что изображение в
микроскопе получается увеличенным и
обратным, приходится учитывать постоянно.

Так как изображение получается обратным,
то наблюдатель, желая передвинуть
деталь, должен сделать обратное движение,
т.е. чтобы деталь передвинулась вправо,
надо подвинуть препарат налево, чтобы
деталь переместилась вверх, надо
передвинуть препарат вниз, и т.д.

Рис. 1. Упрощенная схема хода лучей в
микроскопе.

/ — объектив; 2 — окуляр;А —В
— объект;Bt—Ai— изображение,
даваемое объективом;В2—Аг— изображение,
увеличенное окуляром.

Так как изображение
получается во много раз увеличенным,
надо учитывать, что даже небольшое
передвижение препарата вызовет
значительное перемещение его в поле
зрения микроскопа.

Основными
конструктивными частями микроскопа
являются, с одной стороны, штатив,
объединяющий механические и осветительные
приспособления, с другой – оптические
линзы.

Ниже приводятся две модели
микроскопа: микроскоп М-9 (рис. 2) с
вертикальным тубусом, и микроскоп МБИ-1
(рис. 3) с наклонным съемным тубусом.
Штатив микроскопа состоит из следующих
частей (см. рис. 2 и 3).

Подставка (1)
имеет подковообразную или прямоугольную
форму для придания микроскопу устойчивости.

Тубусодержатель
(2) вертикально
закреплен на подставке, выполняя
одновременно роль ручки для переноса
микроскопа.

Тубус (3) подвижно
соединен с держателем, он несет оптические
линзы.

Футляр призмы
(4) связывает
нижний конец тубуса с его держателем.
Закрепление тубуса в специальном кольце
производится посредством расположенного
справа винта.

Передвижение тубуса
достигается двумя винтами, один из
которых служит для грубого, а другой
для тонкого передвижения.
Кремальера (5) –
винт для грубого передвижения тубуса,
имеет два барашка (ручки в виде колеса),
вынесенные на обе стороны микроскопа.

У моделей с прямым тубусом кремальера
находится в верхней части тубусодержателя,
у моделей с наклонным тубусом кремальера
находится внизу, ниже столика микроскопа.

Рис. 2. Микроскоп М-9.
Рис. 3. Микроскоп МБИ-1.

Микрометрический
винт (6) служит
для тонкого передвижения тубуса. В
различных моделях микроскопов он устроен
по-разному. Микрометрический винт –
наиболее тонкая деталь штатива микроскопа.

Небрежным обращением его легко испортить.
Его нельзя и не нужно сильно вращать.
Так как один оборот барашка микрометрического
винта соответствует перемещению тубуса
на 0,1 мм, то
вполне достаточно вращать микрометрический
винт примерно на пол-оборота.

При всяком
затруднении в работе микрометрического
винта надо сообщить об этом преподавателю,
но ни в коем случае не пытаться это
исправить самостоятельно.

На нижнем конце
тубуса крепится револьвер
(7) –
приспособление для смены объективов.
Он представляет собою вращающуюся
пластинку с винтовыми гнездами для 2, 3
или 4 объективов.

Центрированное положение
объектива определяется особой пружинящей
пластинкой с острием, входящим в линейную
нарезку, расположенную против каждого
гнезда объектива.

ПОДРОБНЕЕ:   Цитологическое диагностическое исследование и результаты — LiveAcademy

Препарат помещают
на предметный
столик (8), имеющий
отверстие, центр которого совпадает с
осью тубуса. Столик бывает квадратным
или круглым. Квадратные столики всегда
неподвижны, круглые столики бывают как
неподвижные, так и двигающиеся.

Подвижные
столики могут вращаться вокруг оси и,
кроме того, имеют движение по двум
перпендикулярным диагоналям, что
позволяет плавно подводить в центр поля
зрения нужное место препарата.

Для этого
служат винты
диагонального перемещения (9), расположенные
на столике справа и слева. На предметном
столике имеются гнезда, в которые
вставляются зажимы
(клеммы) (10) –
две пружинящие пластинки, служащие для
фиксирования микроскопического
препарата.

Под предметным
столиком располагается осветительное
приспособление – зеркало
(11), укрепленное
на подвижном держателе, что позволяет
направлять световые лучи на объект.

Одна поверхность зеркала плоская, другая
вогнутая. При специальных осветителях
для микроскопа, снабженных точечными
лампами, употребляется плоское зеркало.

Осветительный
аппарат (12) состоит
из конденсора – плосковыпуклой линзы,
помещающейся в особом кольце, где он
зажимается специальным винтом
конденсора (13).

Этот
винт нельзя трогать, так как это может
повести к нарушению центрировки
осветительного приспособления. Кольцо
конденсора соединено с ирис-диафрагмой,
привинченной снизу к конденсорному
кольцу.

При помощи ирис-диафрагмы
регулируется количество света, попадающего
на объект. Сужение или расширение
ирис-диафрагмы осуществляется плоским
рычажком
диафрагмы (14), выведенным
сбоку осветителя.

Оптические системы
микроскопа состоят из объективов,
которые ввинчиваются в гнезда револьвера,
и окуляров, которые свободно вставляются
в отверстие тубуса.

Современные
объективы представляют собою различно
скомбинированные системы линз,
объединенных в единой оправе. Обязательной
частью таких систем является плоско-выпуклая
фронтальная (т. е.

направленная к
объективу) линза, диаметр которой тем
менее, чем сильнее увеличение, даваемое
объективом. Наиболее употребительными
объективами являются: 8х (слабый), 20х
(средний), 40х (сильный) и 90х (очень сильный).

Однако надо иметь в виду, что качество
оптики определяется не увеличением,
даваемым линзами, а их разрешающей
способностью, позволяющей наблюдателю
различать отдельно две предельно
приближенные друг к другу линии.

Эта
разрешающая способность объектива
характеризуется так называемой апертурой,
цифра которой
также указывается на футляре объектива
ниже цифры увеличения.

По особенностям
конструкции и способу применения
объективы разделяются на сухие (8х, 20х,
40х) и иммерсионные (60х, 90х). При работе с
сухими объективами между фронтальной
линзой объектива и стеклом препарата
находится воздух.

Стекло имеет показатель
преломления 1,52, а показатель преломления
воздуха равен 1,0. Поэтому, когда лучи
света из покровного стекла препарата
попадают в воздух, они преломляются.

При сильных объективах с малым свободным
расстоянием, у которых фронтальная
линза оказывается очень близко от
препарата, большинство световых лучей
отклоняется и не попадает в объектив;

поле зрения при этом оказывается слишком
темным. Избежать этого можно, помещая
между стеклом препарата и фронтальной
линзой объектива такую среду, которая
имеет показатель преломления, близкий
к стеклу.

Такой средой является
иммерсионное масло, имеющее показатель
преломления 1,51. В каплю масла, нанесенную
на покровное стекло препарата, опускается
фронтальная линза объектива и тогда
световые лучи, не преломляясь, попадают
в объектив и дают ярко освещенное поле
зрения.

Поэтому такие объективы называются
иммерсионными, т. е. погружными. Свободное
расстояние (т. е. расстояние между
препаратом и фронтальной линзой
объектива) у них очень мало, поэтому при
работе с иммерсионными объективами
требуется особая осторожность.

Неосторожным движением кремальеры или
даже резким движением микрометрического
винта легко можно раздавить препарат
или повредить линзу этого дорогого
объектива.

Линзы объективов
должны быть идеально чистыми, для этого
используется специальная салфетка. Ни
в коем случае нельзя протирать объектив
пальцем или платком!

Окуляр состоит
из верхней – глазной линзы и нижней –
полевой, или собирательной, линзы.
Назначение последней – собирать лучи,
расходящиеся от объектива, а глазной
линзы – увеличивать изображение, данное
объективом.

Увеличение объекта
определяется произведением увеличения,
полученного от объектива, на увеличение
окуляра.

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Медицинский взгляд на еду
Adblock
detector